この方法により、繊維アライメントのレベルを制御した3Dコラーゲンヒドロゲルを設計して、体内の健康な組織や病気の組織に見られる環境をモデル化することができます。この技術は、整列コラーゲンヒドロゲルを設計し、細胞を導入し、トポグラフィー的に定義された3D環境で細胞がどのように振る舞うかを定量化するためのシンプルなマイクロ流体アプローチを提供します。手順を実演するのは、私の研究室のニール・ジョシ、メヘラン・マンスーリ、アン・バイアリー、ジャスティン・ヴィダスです。
まず、厚さ250マイクロメートルのPDMSシートをプラスチックキャリアに取り付け、クラフトカッターを使用して、ブレードの深さ0.5ミリメートル、毎秒1センチメートルの速度、および高い力でマイクロ流体設計をかみそりで切断します。超音波浴を使用して、マイクロ流体チャネルの切り欠きを5分間洗浄します。超音波処理されたチャネルを脱イオン水ですすぎ、5分間摂氏100度のホットプレートで乾燥させます。
使用するまで、チャネルを清潔で蓋をしたペトリ皿に保管します。PDMSカバー層を作製し、将来の改質のために表面を機能化するために、49ミリリットルのアセトンに1ミリリットルのアミノプロピルトリエトキシシランを加えて、ガラスビーカーに2%アミノプロピルトリエトキシシラン溶液を調製する。次に、25%グルタルアルデヒド溶液を5%の脱イオン水に希釈します。
24ミリメートル×50ミリメートルのカバースリップごとに2ミリリットルの溶液を作ります。IPAを使用してバス超音波処理器のカバースリップを5分間清掃します。脱イオン水を使用してカバースリップからIPAを洗い流します。
カバースリップの滑らかな水の膜は、IPAが完全にすすがれていることを示しています。カバースリップをホットプレートで摂氏100度で5分間乾燥させます。乾燥したカバースリップをきれいなペトリ皿に入れ、重ならないようにします。
コロナ放電ワンドを使用して、カバースリップをコロナ放電にそれぞれ1分間さらします。コロナ暴露から5分以内にカバースリップを取り外し、各カバースリップをアミノプロピルトリエトキシシラン溶液に10秒間浸し、カバースリップが水没していることを確認してから、カバースリップをアミノプロピルトリエトキシシラン溶液から取り外し、アセトンに10秒間浸し、圧縮空気で乾燥させます。乾いたカバースリップをペトリ皿に戻し、処理面を上に向けてください。
各カバースリップの表面に1ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液をピペットで貼り付けます。溶液がカバースリップの端からこぼれないように、できるだけ多くの表面を覆います。カバースリップを溶液に30分間接触させてから、脱イオン水で20秒間すすぎます。
圧縮空気を使用してカバースリップを乾燥させ、プラズマ処理面を上にしてペトリ皿に戻します モジュラー磁気ベースをレーザー切断するには、パス数や出力などの適切なレーザー設定を使用してPMMA層から設計を切り取ります。磁石をPMMA層に圧入できるように、レーザー設定を調整する必要があります。石鹸と水を使用してレーザーカット部分を洗浄し、レーザーカットプロセスから破片を取り除きます。
溶剤は、レーザーカットされたエッジにマイクロクラックを伝播する可能性があるため、使用しないでください。プラットフォームを組み立てるには、磁石を手でレーザーカットされたベースに押し込みます。磁石の厚さは、磁石がベースの表面と同じ高さになるように、PMMAベースの厚さよりも小さくする必要があります。
粘着剤または粘着シートから裏地をはがし、機能面を上に向けてグルタルアルデヒド処理したカバースリップにベースを取り付けます。PDMSチャンネルカットアウトをフレームで定義されたキャビティにそっと配置します。ワイドチップピンセットで押し下げて気泡を取り除き、コンフォーマルコンタクトを確保します。
ウシ血清アルブミンまたはBSA処理されたチャンネルカバーを、BSA側を下に向けてチャンネルカットアウトの上に置きます。液体の入口ポートと出口ポートがチャネルと揃っていることを確認します。デバイスはコラーゲンI注射の準備ができています。
シリンジポンプ、冷やした滅菌シリンジ、冷やした中和コラーゲンI溶液、および滅菌20ゲージの90度角度チップルアーロックニードルをバイオセーフティキャビネットに入れます。コラーゲンI溶液をシリンジに入れ、気泡を避けます。針先をシリンジに取り付け、注射器を注射器ポンプにロードし、針を下に向けて、コラーゲンI溶液で針をプライミングします。
シリンジポンプを毎分50〜2, 000マイクロリットルの必要な流量に設定します。準備したPDMSチャンネルをラボジャックに置き、針と同じ高さにします。PDMSチャンネルの入口ポートに針を挿入します。
出口側に30マイクロリットルのコラーゲンが溜まるまでチャネルを注入します。ラボジャックを下げ、新しく充填されたチャネルから針をそっと分離します。すべてのチャンネルがコラーゲンI溶液で満たされるまで繰り返します。
新しく形成されたコラーゲンIゲルの脱水を防ぐために、脱イオン水で飽和した清潔で糸くずの出ないワイプと一緒に、充填されたチャネルをペトリ皿に入れます。ペトリ皿を覆い、装填したチャンネルをインキュベーターに2時間入れてから、剥離ステップを行います。ピールオフと培地平衡化のために、ピンセットを使用してPDMSカバーを持ち上げ、重合コラーゲンIゲルを露出させることから始めます。
650マイクロリットルの内皮増殖培地をウェルに加えます。または、別のモジュールを取り付けて、追加のコラーゲン層を導入するか、培地灌流機能を提供します。デバイスをインキュベーターに最低4時間放置して、ゲルと培地を平衡化します。
細胞を播種する前に培地を交換してください。ガラスカバースリップを機能化することでチャネルリフトオフを可能にし、PDMSカバーをBSAで機能化することでコラーゲンIの付着を防止しました。コラーゲンI線維のアライメントは、カバーを持ち上げた後も影響を受けませんでした。
マトリックスの整列したセグメント上で培養されたHUVECの画像は、ランダムな繊維を有するセグメント上のHUVECと比較して、アクチン線維の整列の増加を示しました。私たちのアプローチにより、腫瘍の微小環境をモデル化し、さまざまな細胞タイプがどのように反応するかを定量化することができます。また、長期実験をサポートするために流路を導入することもできます。
