이 방법을 사용하면 신체의 건강한 조직과 병든 조직에서 발견되는 환경을 모델링하기 위해 제어된 수준의 섬유 정렬을 가진 3D 콜라겐 하이드로겔을 설계할 수 있습니다. 이 기술은 정렬된 콜라겐 하이드로겔을 엔지니어링하고, 세포를 도입하고, 지형적으로 정의된 3D 환경에서 세포가 어떻게 행동하는지 정량화하는 간단한 미세유체 접근 방식을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly 및 Justin Vidas가 될 것입니다.
먼저 250마이크로미터 두께의 PDMS 시트를 플라스틱 캐리어에 장착하고 크래프트 커터를 사용하여 0.5mm의 블레이드 깊이, 초당 1cm의 속도 및 높은 힘으로 미세유체 설계를 면도날로 절단합니다. 초음파 수조를 사용하여 미세유체 채널 컷아웃을 5분 동안 청소합니다. 초음파 처리 된 채널을 탈 이온수로 헹구고 섭씨 100도에서 5 분 동안 핫 플레이트에서 건조시킵니다.
사용할 때까지 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 채널을 보관하십시오. PDMS 커버층을 제조하고 향후 변형을 위해 표면을 기능화하기 위해, 49 밀리리터의 아세톤에 1 밀리리터의 아미노프로필 트리에톡시실란을 첨가하여 유리 비커에서 2%아미노프로필 트리에톡시실란 용액을 제조한다. 다음으로, 25 % 글루 타르 알데히드 용액을 5 % 탈 이온수로 희석한다.
각 24mm x 50mm 커버 슬립에 대해 2 밀리리터의 용액을 만듭니다. IPA를 사용하여 5분 동안 목욕 초음파 처리기에서 커버 슬립을 청소하십시오. 탈이온수를 사용하여 커버 슬립에서 IPA를 헹굽니다.
커버 슬립의 부드러운 물막은 IPA가 완전히 헹궈졌음을 나타냅니다. 섭씨 100도에서 5 분 동안 핫 플레이트에서 덮개 슬립을 건조시킵니다. 건조된 덮개 슬립을 깨끗한 페트리 접시에 넣고 겹치지 않도록 합니다.
코로나 방전 봉을 사용하여 커버 슬립을 각각 1분 동안 코로나 방전에 노출시킵니다. 코로나 노출 후 5분 이내에 커버 슬립을 제거하고 각 커버 슬립을 아미노프로필 트리에톡시실란 용액에 10초 동안 담그고 커버 슬립이 잠기도록 한 다음 아미노프로필 트리에톡시실란 용액에서 커버 슬립을 제거하고 아세톤에 10초 동안 담그고 압축 공기로 건조시킵니다. 마른 덮개 슬립을 처리된 면이 위를 향하도록 페트리 접시에 다시 놓습니다.
1밀리리터의 글루타르알데히드 용액을 각 커버 슬립의 표면에 피펫팅합니다. 용액이 덮개 슬립의 가장자리 위로 쏟아지지 않도록 가능한 한 많은 표면을 덮으십시오. 커버 슬립을 용액에 30분 동안 그대로 둔 다음 탈이온수로 20초 동안 헹굽니다.
압축 공기를 사용하여 커버 슬립을 건조시키고 플라즈마 처리된 면이 위로 향하게 하여 페트리 접시에 다시 넣습니다. 모듈식 마그네틱 베이스를 레이저 절단하는 경우 패스 수 및 출력과 같은 적절한 레이저 설정을 사용하여 PMMA 레이어에서 설계를 잘라냅니다. 자석이 PMMA 레이어에 압입될 수 있도록 레이저 설정을 조정해야 합니다. 레이저 절단 공정에서 이물질을 제거하기 위해 비누와 물을 사용하여 레이저 절단 부품을 세척합니다.
솔벤트는 레이저 절단 가장자리에 미세 균열을 전파할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 플랫폼을 조립하려면 손으로 자석을 레이저 절단 베이스에 밀어 넣습니다. 자석의 두께는 자석이 베이스 표면과 같은 높이가 되도록 PMMA 베이스의 두께보다 작아야 합니다.
감압 접착제 또는 PSA 시트에서 뒷면을 떼어내고 기능성 면이 위를 향하도록 베이스를 글루타르알데히드 처리된 커버 슬립에 부착합니다. PDMS 채널 컷아웃을 프레임에 의해 정의된 캐비티에 부드럽게 배치합니다. 끝이 넓은 핀셋으로 눌러 기포를 제거하고 등각 접촉을 보장합니다.
소 혈청 알부민 또는 BSA 처리 채널 커버를 BSA 면이 아래를 향하도록 하여 채널 컷아웃 위에 놓습니다. 유체 입구 및 출구 포트가 채널과 정렬되어 있는지 확인하십시오. 장치가 콜라겐 I 주입 준비가 되었습니다.
주사기 펌프, 냉장 멸균 주사기, 냉장 중화 콜라겐 I 용액 및 멸균 20게이지 90도 각도 팁 루어 잠금 바늘을 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 콜라겐 I 용액을 주사기에 넣고 기포를 피하십시오. 바늘 끝을 주사기에 부착하고 주사기를 주사기 펌프에 넣고 바늘이 아래를 향하도록 한 다음 바늘에 콜라겐 I 용액을 프라이밍합니다.
주사기 펌프를 분당 50에서 2, 000 마이크로 리터 사이의 필요한 유량으로 설정하십시오. 준비된 PDMS 채널을 실험실 잭에 놓고 바늘로 수평을 맞춥니다. PDMS 채널의 입구 포트에 바늘을 삽입합니다.
30마이크로리터의 콜라겐 I이 출구 쪽에 모일 때까지 채널을 주입합니다. 실험실 잭을 내리고 새로 채워진 채널에서 바늘을 부드럽게 분리합니다. 모든 채널이 콜라겐 I 용액으로 채워질 때까지 반복합니다.
새로 형성된 콜라겐 I 젤의 탈수를 방지하기 위해 탈이온수로 포화된 깨끗하고 보푸라기가 없는 물티슈와 함께 채워진 채널을 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 덮고 필오프 단계 전에 적재된 채널을 인큐베이터에 2시간 동안 두십시오. 필 오프 및 배지 평형을 위해 핀셋을 사용하여 PDMS 커버를 들어 올려 중합된 콜라겐 I 겔을 노출시키는 것으로 시작합니다.
650 마이크로 리터의 내피 성장 배지를 우물에 첨가하십시오. 또는 다른 모듈을 부착하여 추가 콜라겐 층을 도입하거나 배지 관류 기능을 제공합니다. 젤과 배지의 평형을 맞추기 위해 최소 4시간 동안 장치를 인큐베이터에 두십시오.
셀로 시드하기 전에 미디어를 교체하십시오. 유리 커버 슬립을 기능화하여 채널 리프트오프를 가능하게 하고 BSA로 PDMS 커버를 기능화하여 콜라겐 I 부착을 방지했습니다. 콜라겐 I 섬유 정렬은 덮개를 들어 올린 후에도 영향을 받지 않았습니다.
매트릭스의 정렬된 세그먼트에서 배양된 HUVEC의 이미지는 무작위 섬유를 갖는 세그먼트의 HUVEC에 비해 증가된 액틴 섬유 정렬을 보여주었습니다. 우리의 접근 방식을 통해 종양 미세 환경을 모델링하고 다양한 세포 유형이 어떻게 반응하는지 정량화할 수 있습니다. 또한 장기 실험을 지원하기 위해 흐름 채널을 도입할 수 있습니다.
