Este método nos permite diseñar hidrogeles de colágeno 3D con niveles controlados de alineación de fibras para modelar entornos que se encuentran en tejidos sanos y enfermos en el cuerpo. Esta técnica proporciona un enfoque microfluídico simple para diseñar hidrogeles de colágeno alineados, introducir células y cuantificar cómo se comportan las células en entornos 3D definidos topográficamente. Demostrando el procedimiento estarán Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly y Justin Vidas para mi laboratorio.
Para comenzar, monte una lámina PDMS de 250 micrómetros de espesor en un portador de plástico y corte con una navaja el diseño microfluídico con un cortador artesanal a una profundidad de cuchilla de 0,5 milímetros, velocidad de un centímetro por segundo y alta fuerza. Usando un baño ultrasónico, limpie los recortes del canal microfluídico durante cinco minutos. Enjuague los canales sonicados en agua desionizada y séquelos en una placa caliente a 100 grados centígrados durante cinco minutos.
Guarde los canales en una placa de Petri limpia y cubierta hasta que los use. Para fabricar la capa de cobertura de PDMS y funcionalizar la superficie para futuras modificaciones, prepare una solución de trietoxisilano de aminopropilo al 2% en un vaso de precipitados de vidrio agregando un mililitro de trietoxisilano de aminopropilo a 49 mililitros de acetona. A continuación, diluya una solución de glutaraldehído al 25% al 5% en agua desionizada.
Haga dos mililitros de solución por cada cubreobjetos de 24 milímetros por 50 milímetros. Limpie los resbalones de la cubierta en un sonicador de baño durante cinco minutos usando IPA. Enjuague el IPA de los cubreobjetos con agua desionizada.
Una película lisa de agua en el cubreobjetos indica que el IPA está bien enjuagado. Seque los deslizamientos de la cubierta en una placa caliente durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Coloque los deslizamientos de la cubierta seca en placas de Petri limpias, asegurándose de que no se superpongan.
Usando una varita de descarga de corona, exponga los resbalones de cubierta a una descarga de corona durante un minuto cada uno. Retire los cubreobjetos dentro de los cinco minutos posteriores a la exposición a la corona y sumerja cada resbalón de cubierta en la solución de aminopropiltrietoxisilano durante 10 segundos, asegurándose de que el cubreobjetos esté sumergido Luego, retire los cubreobjetos de la solución de aminopropil trietoxisilano, sumérjalos en acetona durante 10 segundos y séquelos con aire comprimido. Coloque el deslizamiento de la cubierta seca de nuevo en la placa de Petri, con el lado tratado hacia arriba.
Pipetear un mililitro de solución de glutaraldehído sobre la superficie de cada cubreobjetos. Cubra la mayor superficie posible sin permitir que la solución se derrame sobre el borde del cubreobjetos. Deje que los deslizamientos de la cubierta reposen en contacto con la solución durante 30 minutos y luego enjuague con agua desionizada durante 20 segundos.
Seque los cubreobjetos con aire comprimido y vuelva a colocarlos en las placas de Petri, el lado tratado con plasma hacia arriba Para cortar con láser la base magnética modular, corte los diseños de la capa de PMMA utilizando los ajustes de láser apropiados, como el número de pasadas y la potencia. Los ajustes del láser deben ajustarse para que los imanes puedan colocarse a presión en la capa de PMMA. Lave la pieza cortada con láser con agua y jabón para eliminar los residuos del proceso de corte por láser.
No utilice disolventes, ya que pueden propagar microfisuras en los bordes cortados con láser. Para ensamblar la plataforma, empuje los imanes a mano en la base cortada con láser. El grosor de los imanes debe ser menor que el grosor de la base de PMMA para garantizar que los imanes estén al ras de la superficie de la base.
Despegue el respaldo del adhesivo sensible a la presión, o lámina de PSA, y fije la base a un cubreobjetos tratado con glutaraldehído con el lado funcionalizado hacia arriba. Coloque suavemente el recorte del canal PDMS en la cavidad definida por el marco. Presione hacia abajo con pinzas de punta ancha para eliminar las burbujas de aire y garantizar el contacto conformado.
Coloque la albúmina sérica bovina o la cubierta del canal tratada con BSA en la parte superior del recorte del canal con el lado de BSA hacia abajo. Asegúrese de que los puertos de entrada y salida del fluido estén alineados con el canal. El dispositivo está listo para la inyección de colágeno I.
Coloque una bomba de jeringa, una jeringa estéril refrigerada, una solución de colágeno I neutralizado refrigerado y una aguja luer lock estéril de calibre 20 grados de ángulo de 90 grados en un gabinete de bioseguridad. Cargue la solución de colágeno I en la jeringa, evitando burbujas. Conecte la punta de la aguja a la jeringa, cargue la jeringa en la bomba de la jeringa, con la aguja hacia abajo, y prepare la aguja con la solución de colágeno I.
Ajuste la bomba de jeringa al caudal requerido entre 50 y 2, 000 microlitros por minuto. Coloque los canales PDMS preparados en un conector de laboratorio y nivele con la aguja. Inserte la aguja en el puerto de entrada del canal PDMS.
Inyecte el canal hasta que se acumule una gota de 30 microlitros de colágeno I en el lado de salida. Baje el gato de laboratorio y separe suavemente la aguja del canal recién llenado. Repita hasta que todos los canales se hayan llenado con la solución de colágeno I.
Cargue los canales llenos en las placas de Petri junto con una toallita limpia y sin pelusa saturada con agua desionizada para evitar la deshidratación del gel de colágeno I recién formado. Cubra la placa de Petri y coloque los canales cargados en la incubadora durante dos horas antes del paso de despegado. Para el despegado y el equilibrio de los medios, comience por levantar la cubierta PDMS con pinzas para exponer el gel de colágeno I polimerizado.
Agregue 650 microlitros de medios de crecimiento endotelial al pozo. Alternativamente, conecte otro módulo para introducir una capa de colágeno adicional o proporcionar capacidades de perfusión de medios. Deje los dispositivos en la incubadora durante un mínimo de cuatro horas para equilibrar el gel y el medio.
Reemplace el medio antes de sembrar con celdas. La funcionalización del deslizamiento de la cubierta de vidrio permitió el despegue del canal y la funcionalización de la cubierta PDMS con BSA evitaron la fijación de colágeno I. La alineación de la fibra de colágeno I no se vio afectada después de levantar la cubierta.
Las imágenes de los HUVEC cultivados en el segmento alineado de la matriz mostraron una mayor alineación de la fibra de actina en comparación con los HUVEC en el segmento con fibras aleatorias. Nuestro enfoque nos permite modelar el microambiente tumoral y cuantificar cómo responden los diferentes tipos de células. También podemos introducir canales de flujo para apoyar experimentos a largo plazo.
