该方法允许分离肝癌组织来源的小细胞外囊泡，其纯度高于经典的差示超速离心。该技术简单、方便、易于操作，可为小细胞外囊泡的研究提供方法学支持。首先，从 80 摄氏度的冰箱中取出组织样本。
将大约400毫克的组织放入冰盒上的10厘米细胞培养皿中，并用手术刀将组织切碎。将组织转移到装有1.5毫升消化液的六孔板中。然后，将板放在移位脱色摇床上，并在37摄氏度下孵育20分钟，以完全解离肝癌组织并释放小细胞外囊泡或sEV。
孵育后，将六孔板放在冰盒上。加入80微升磷酸酶抑制剂和200微升完全蛋白酶抑制剂溶液以停止消化。然后，将消化溶液转移到放置在两毫升离心管上的70微米细胞过滤器中，并缓慢过滤以去除任何大的组织碎片。
将滤液以500g离心10分钟以除去小组织碎片，并将上清液收集在新的两毫升离心管中。将上清液以3， 000g离心20分钟以除去细胞碎片。小心地将上清液转移到新的离心管中，直到移液器的尖端即将接触底部的白色碎片。
重复离心剩余液体后，将上清液汇集到管中而不干扰碎屑。将收集的上清液以12， 000g离心20分钟，并将900微升上清液转移到4.7毫米超速离心管中。重复离心剩余的液体，然后收集并将两种上清液混合到同一超速离心管中。
用PBS完全填充管子。将上清液以100， 000g离心60分钟。弃去上清液后，通过用PBS填充超速离心管来重悬沉淀。
在以100， 000g重复离心60分钟后，用50微升PBS重悬沉淀。使用一毫升无菌注射器吸出sEV悬浮液，并通过0.22微米膜过滤器将其过滤到600微升离心管中。将滤液储存在80摄氏度下进行进一步分析。
使用纳米颗粒流式细胞仪确定sEV的尺寸分布和纯度。检查清洁溶液的体积。然后，注意护套和废液的水平之间的差异。
打开仪器主电源20秒后，打开计算机。等待蜂鸣音指示仪器已正确连接以运行软件。单击启动以打开相机、激光器和气泵。
接下来，单击护套流，然后选择启动，将超纯水放在装载平台上。四分钟后，单击“采样和提升”，然后选择“在样本中卸载”。30秒后，将空白管放在装载平台上。
单击“示例”，选择“提升”，然后选择“在示例中卸载”。然后，将装有超纯水的管放在装载平台上。同时，单击“采样和提升”，然后单击“护套流”和“清除”。
单击手动操作，然后将颗粒浓缩管放在装载平台上。然后，单击“样品”，选择“增强”一分钟，同时在“样品信息”中选择“250纳米标准荧光二氧化硅纳米球质量控制”。选择从样本中采样，然后单击 SPCM 打开检测器。
然后，单击自动采样，并在采样集中输入 1.0 以将压力固定在一千帕。单击工具栏，然后选择大信号。调整激光器的水平位置，并将激光器设置为两微米。
然后，连续单击L和R以确保信号强且均匀。单击“记录时间”以收集数据，完成后会自动跳转到“缓冲区”。然后，将数据保存在 Nfa 文件中，然后单击“示例”以选择“卸载”。
将清洁溶液管放在装载平台上。单击“采样”，选择“提升”，一分钟后单击“采样和卸载”。使用超纯水从毛细管尖端去除残留的清洁溶液。
将粒径标准管放在装载平台上，然后单击样品提升一分钟。在样品信息中选择 68 到 155 S16M-Exo 质量控制，然后单击样品，然后单击采样。接下来，单击工具栏，然后选择小信号。
单击“记录时间”以收集数据，完成后会自动跳转到“缓冲区”。然后，将数据保存在 Nfa 文件中，然后单击“示例”以选择“卸载”。用清洁溶液去除残留物后，将PBS管放在装载平台上，并执行针对粒径标准管演示的步骤。
接下来，如前所述清洁毛细管尖端，并加载sEV样品以分析前面描述的粒径标准管的数据。在透射电子显微镜下检查纯化的sEVs，揭示了具有杯形形态的sEV的存在。对sEV进行了流式细胞术。
粒径范围从40纳米到200纳米，平均粒径为89纳米。富集sEVs的纯度为68.32%，蛋白质免疫印迹法检测sEV的CD63、CD9、TSG101等蛋白标志物。GM130被用作sEVs的阴性对照标志物，在组织细胞中发现，但在sEV中没有发现。
至关重要的是要非常小心地执行酶消化、差示超速离心和膜过滤步骤，以确保小细胞外囊泡的纯度。
