Cette méthode permet d’isoler de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie avec une pureté supérieure à celle obtenue par ultracentrifugation différentielle classique. Cette technologie est simple, pratique et facile à utiliser, ce qui peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude de petites vésicules extracellulaires. Pour commencer, retirez l’échantillon de tissu du congélateur à 80 degrés Celsius.
Placez environ 400 milligrammes de tissu dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres sur la glacière et hachez finement le tissu avec un scalpel. Transférer le tissu dans une plaque à six puits avec 1,5 millilitre de solution digestive. Ensuite, placez la plaque sur le shaker décolorant de transfert et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour une dissociation complète du tissu cancéreux du foie et la libération des petites vésicules extracellulaires, ou sEV.
Après l’incubation, placez la plaque à six puits sur la glacière. Ajouter 80 microlitres d’inhibiteur de phosphatase et 200 microlitres de solution complète d’inhibiteur de protéase pour arrêter la digestion. Ensuite, transférez la solution digestive dans une crépine cellulaire de 70 micromètres placée sur un tube à centrifuger de deux millilitres et filtrez-la lentement pour éliminer les gros débris tissulaires.
Centrifuger le filtrat à 500 g pendant 10 minutes pour éliminer les petits débris tissulaires et recueillir le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de deux millilitres. Centrifuger le surnageant à 3 000 g pendant 20 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger jusqu’à ce que l’extrémité de la pipette soit sur le point de toucher les débris blancs au fond.
Après avoir répété la centrifugation du liquide restant, enrouler le surnageant dans le tube sans déranger les débris. Centrifuger le surnageant collecté à 12 000 g pendant 20 minutes et transférer 900 microlitres du surnageant dans un tube à ultracentrifugation de 4,7 millimètres. Répéter la centrifugation du liquide restant, puis recueillir et mélanger les deux surnageants dans le même tube à ultracentrifugation.
Remplissez complètement le tube avec du PBS. Centrifuger le surnageant à 100 000 g pendant 60 minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension en remplissant le tube à ultracentrifugeuses de PBS.
Après avoir répété la centrifugation à 100 000 g pendant 60 minutes, remettre la pastille en suspension avec 50 microlitres de PBS. Aspirez la suspension sEV à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre et filtrez-la à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre dans un tube à centrifuger de 600 microlitres. Conservez le filtrat à 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie.
Utilisez un cytomètre à flux de nanoparticules pour déterminer la distribution granulométrique et la pureté des sEV. Vérifiez le volume de la solution de nettoyage. Ensuite, notez la différence entre les niveaux de la gaine et du liquide résiduaire.
Après 20 secondes de mise sous tension de l’alimentation principale de l’instrument, allumez l’ordinateur. Attendez les bips indiquant que l’instrument est correctement connecté pour exécuter le logiciel. Cliquez sur Démarrer pour allumer la caméra, le laser et la pompe à air.
Ensuite, cliquez sur Sheath Flow et sélectionnez Start Up.Placez de l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Après quatre minutes, cliquez sur Sample and Amping (Exemple et amplification), puis sélectionnez Décharger dans l’échantillon. Après 30 secondes, placez le tube vierge sur la plate-forme de chargement.
Cliquez sur Sample, sélectionnez Boosting, puis sélectionnez Décharger dans l’échantillon. Ensuite, placez le tube contenant l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Simultanément, cliquez sur Échantillon et Boosting, puis sur Sheath Flow et Purge.
Cliquez sur Manual Operation (Fonctionnement manuel) et placez le tube de concentration de particules sur la plate-forme de chargement. Ensuite, cliquez sur Échantillon, sélectionnez Booster pendant une minute, puis sélectionnez simultanément le contrôle qualité des nanosphères de silice fluorescente standard de 250 nanomètres dans Informations sur l’échantillon. Sélectionnez Échantillonnage à partir de l’échantillon et allumez le détecteur en cliquant sur SPCM.
Ensuite, cliquez sur Échantillonnage automatique et entrez 1.0 dans le jeu d’échantillonnage pour fixer la pression à un kilopascal. Cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Large Signal (Signal volumineux). Ajustez la position horizontale du laser et réglez le laser sur deux micromètres.
Ensuite, cliquez continuellement sur L et R pour vous assurer que le signal est fort et uniforme. Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passent automatiquement à Buffer lorsque vous avez terminé. Ensuite, enregistrez les données dans le fichier Nfa et cliquez sur Exemple pour sélectionner Décharger.
Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement. Cliquez sur Sample, sélectionnez Boosting, et après une minute, cliquez sur Sample and Unload. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
Placez le tube standard de taille de particules sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample Boosting pendant une minute. Sélectionnez 68 à 155 S16M-Exo quality control dans Sample Information (Informations sur l’échantillon), puis sur Sample (Échantillonnage), puis sur Sampling (Échantillonnage). Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.
Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passent automatiquement à Buffer lorsque vous avez terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Nfa et cliquez sur Exemple pour sélectionner Décharger. Après avoir éliminé les résidus avec la solution de nettoyage, placez le tube PBS sur la plate-forme de chargement et effectuez les étapes indiquées pour le tube standard granulométrique.
Ensuite, nettoyez l’extrémité capillaire comme démontré précédemment et chargez l’échantillon sEV pour analyser les données décrites précédemment pour le tube standard de taille de particule. Les sEV purifiés ont été examinés au microscope électronique à transmission, qui a révélé la présence de sEV avec une morphologie en forme de coupe. Une cytométrie en flux pour les sEV a été réalisée.
Et la taille des particules variait de 40 à 200 nanomètres, et la taille moyenne des particules était de 89 nanomètres. La pureté des sEV enrichis s’est avérée être de 68,32%Les marqueurs protéiques des sEV tels que CD63, CD9 et TSG101 ont été détectés par transfert Western. GM130 a été utilisé comme marqueur de contrôle négatif des sEV, qui a été trouvé dans les cellules tissulaires mais pas dans les sEV.
Il est crucial d’effectuer les étapes de la digestion enzymatique, de l’ultracentrifugation différentielle et de la filtration membranaire avec le plus grand soin pour assurer la pureté des petites vésicules extracellulaires.
