שיטה זו מאפשרת בידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן בסרטן הכבד בעלות טוהר גבוה מזה המושג על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית קלאסית. טכנולוגיה זו היא פשוטה, נוחה וקלה לתפעול, אשר יכולה לספק תמיכה מתודולוגית לחקר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות. כדי להתחיל, להסיר את דגימת הרקמה מהמקפיא 80 מעלות צלזיוס.
מניחים כ-400 מיליגרם של הרקמה לתוך צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ על קופסת הקרח, וטוחנים דק את הרקמה בעזרת אזמל. מעבירים את הרקמה לצלחת בעלת שש בארות עם 1.5 מיליליטר של תמיסת העיכול. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על שייקר שינוי הצבע של העברה, ודגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לדיסוציאציה מוחלטת של רקמת סרטן הכבד ושחרור השלפוחיות החוץ תאיות הקטנות, או sEVs.
לאחר הדגירה, מניחים את צלחת שש בארות על ארגז הקרח. הוסף 80 מיקרוליטר של מעכב phosphatase ו 200 מיקרוליטר של פתרון מעכב פרוטאז מלא כדי לעצור את העיכול. לאחר מכן, העבירו את תמיסת העיכול למסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר המונחת על צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר, וסננו אותה לאט כדי להסיר פסולת רקמות גדולה.
צנטריפוגה את התסנין ב 500 גרם במשך 10 דקות כדי להסיר את פסולת הרקמה הקטנה, ולאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה שני מיליליטר חדש. צנטריפוגה את supernatant ב 3, 000 גרם במשך 20 דקות כדי להסיר את פסולת התא. מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עד שקצה הפיפטה עומד לגעת בפסולת הלבנה שבתחתית.
לאחר חזרה על הצנטריפוגה של הנוזל שנותר, אגרו את הסופרנאטנט לתוך הצינור מבלי להפריע לפסולת. צנטריפוגה את supernatant שנאסף ב 12, 000 גרם במשך 20 דקות, ולהעביר 900 מיקרוליטר של supernatant לצינור אולטרה צנטריפוגה 4.7 מילימטר. חזור על הצנטריפוגה של הנוזל שנותר, ולאחר מכן לאסוף ולערבב את שני supernatants לתוך אותו צינור אולטרה צנטריפוגה.
מלא את הצינור לחלוטין עם PBS. צנטריפוגה supernatant ב 100, 000 גרם במשך 60 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה על ידי מילוי צינור האולטרה-צנטריפוגה ב- PBS.
לאחר חזרה על הצנטריפוגה ב 100, 000 גרם במשך 60 דקות, להשעות מחדש את הגלולה עם 50 מיקרוליטר של PBS. שאפו את מתלה ה-sEV באמצעות מזרק סטרילי של מיליליטר, וסננו אותו דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 600 מיקרוליטר. אחסנו את התסנין בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף.
השתמש בציטומטר זרימת ננו-חלקיקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל והטוהר של כלי הרכב החשמליים. בדוק את עוצמת הקול של תמיסת הניקוי. לאחר מכן, שימו לב להבדל בין רמות הנדן לבין נוזל הפסולת.
לאחר 20 שניות של הפעלת ספק הכוח הראשי של המכשיר, הפעל את המחשב. המתן לצפצופים המציינים שהמכשיר מחובר כראוי כדי להפעיל את התוכנה. לחץ על Start Up כדי להפעיל את המצלמה, הלייזר ומשאבת האוויר.
לאחר מכן, לחץ על זרימת מעטפת, ובחר Start Up.Place מים טהורים במיוחד על פלטפורמת הטעינה. לאחר ארבע דקות, לחץ על דגימה והגברה, ולאחר מכן בחר בטל טעינה בדגימה. לאחר 30 שניות, הנח את הצינור הריק על פלטפורמת הטעינה.
לחץ על דוגמה, בחר הגברה, ולאחר מכן בחר בטל טעינה בדגימה. לאחר מכן, הניחו את הצינור המכיל את המים האולטרה-טהורים על פלטפורמת הטעינה. במקביל, לחץ על Sample and Boosting, ואחריו Sheath Flow ו-Purge.
לחץ על הפעלה ידנית, והנח את צינור ריכוז החלקיקים על פלטפורמת הטעינה. לאחר מכן, לחץ על דגימה, בחר הגברה למשך דקה אחת, ובחר בו זמנית בקרת איכות ננו-ספירות סיליקה פלואורסצנטיות סטנדרטיות של 250 ננומטר במידע מדגם. בחר דגימה מדגימה, והפעל את הגלאי על ידי לחיצה על SPCM.
לאחר מכן, לחץ על דגימה אוטומטית, והזן 1.0 לתוך ערכת דגימה כדי לתקן את הלחץ בקילופסקל אחד. לחץ על סרגל הכלים ובחר אות גדול. התאם את המיקום האופקי של הלייזר והגדר את הלייזר לשני מיקרומטרים.
לאחר מכן, לחץ ברציפות על L ו- R כדי להבטיח שהאות חזק ואחיד. לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר קופצים אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Nfa ולחץ על מדגם כדי לבחור בטל פריקה.
הניחו את צינור תמיסת הניקוי על פלטפורמת הטעינה. לחץ על דוגמה, בחר קידום, ולאחר דקה לחץ על דגימה ופריקה. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להסיר את תמיסת הניקוי השיורית מקצה הנימים.
הניחו את הצינור הסטנדרטי בגודל החלקיקים על פלטפורמת הטעינה, ולחצו על Sample Boosting למשך דקה אחת. בחר בקרת איכות 68 עד 155 S16M-Exo במידע לדוגמה, ולחץ על דגימה ולאחר מכן על דגימה. לאחר מכן, לחץ על סרגל הכלים ובחר אות קטן.
לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר קופצים אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Nfa ולחץ על דוגמה כדי לבחור בטל טעינה. לאחר הסרת השאריות עם תמיסת הניקוי, הניחו את צינור PBS על פלטפורמת הטעינה, ובצעו את השלבים שהודגמו עבור הצינור הסטנדרטי בגודל חלקיקים.
לאחר מכן, נקו את קצה הנימים כפי שהודגם קודם לכן, וטענו את דגימת ה-sEV כדי לנתח את הנתונים שתוארו קודם לכן עבור הצינור הסטנדרטי בגודל חלקיקים. כלי הרכב החשמליים המטוהרים נבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, שחשף את נוכחותם של כלי רכב חשמליים עם מורפולוגיה בצורת גביע. בוצעה ציטומטריית זרימה עבור כלי רכב חשמליים.
וגודל החלקיקים נע בין 40 ל -200 ננומטר, וגודל החלקיקים הממוצע היה 89 ננומטר. טוהר ה-sEV המועשר נמצא ב-68.32%הסמנים החלבוניים של sEVs כגון CD63, CD9 ו-TSG101 זוהו על ידי כתם מערבי. GM130 שימש כסמן הבקרה השלילי של sEVs, אשר נמצא בתאי רקמה אך לא ב- sEVs.
חיוני לבצע את השלבים של עיכול אנזימטי, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון ממברנות בזהירות מרבית כדי להבטיח את טוהר השלפוחיות החוץ תאיות הקטנות.
