Этот метод позволяет выделять небольшие внеклеточные везикулы, полученные из тканей рака печени, с чистотой, превышающей чистоту, достигаемую классическим дифференциальным ультрацентрифугированием. Эта технология проста, удобна и проста в эксплуатации, что может обеспечить методическую поддержку для исследования небольших внеклеточных везикул. Для начала извлеките образец ткани из морозильной камеры при температуре 80 градусов по Цельсию.
Поместите примерно 400 миллиграммов ткани в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток на ящике для льда и мелко измельчите ткань скальпелем. Переложите ткань в шестилуночную пластину с 1,5 миллилитрами пищеварительного раствора. Затем поместите пластину на шейкер для обесцвечивания переноса и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут для полной диссоциации ткани рака печени и высвобождения мелких внеклеточных везикул или sEV.
После инкубации поместите шестилуночную тарелку на ящик со льдом. Добавьте 80 микролитров ингибитора фосфатазы и 200 микролитров полного раствора ингибитора протеазы, чтобы остановить пищеварение. Затем перенесите пищеварительный раствор в 70-микрометровый клеточный фильтр, помещенный в двухмиллилитровую центрифужную пробирку, и медленно отфильтруйте его, чтобы удалить крупный тканевый мусор.
Центрифугируйте фильтрат по 500 г в течение 10 минут, чтобы удалить мелкий тканевый мусор, и соберите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируют надосадочную жидкость в дозе 3 000 г в течение 20 мин для удаления клеточного мусора. Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку до тех пор, пока кончик пипетки не коснется белого мусора на дне.
После повторного центрифугирования оставшейся жидкости сверните надосадочную жидкость в трубку, не нарушая мусора. Центрифугируйте собранную надосадочную жидкость при 12 000 г в течение 20 минут и перенесите 900 микролитров надосадочной жидкости в 4,7-миллиметровую ультрацентрифужную пробирку. Повторите центрифугирование оставшейся жидкости, а затем соберите и смешайте оба надосадочных продукта в одну и ту же ультрацентрифужную пробирку.
Полностью заполните тюбик PBS. Центрифугируют надосадочную жидкость в дозе 100 000 г в течение 60 минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу, заполнив ультрацентрифужную пробирку PBS.
После повторения центрифугирования при 100 000 г в течение 60 минут ресуспендируют гранулу 50 микролитрами PBS. Аспирируйте суспензию sEV с помощью стерильного шприца объемом один миллилитр и отфильтруйте ее через мембранный фильтр размером 0,22 микрометра в центрифужную пробирку объемом 600 микролитров. Храните фильтрат при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа.
Используйте проточный цитометр наночастиц для определения распределения по размерам и чистоты sEV. Проверьте объем чистящего раствора. Затем обратите внимание на разницу между уровнями оболочки и отработанной жидкости.
Через 20 секунд после включения основного питания прибора включите компьютер. Дождитесь звуковых сигналов, указывающих на то, что прибор правильно подключен, чтобы запустить программное обеспечение. Нажмите «Пуск», чтобы включить камеру, лазер и воздушный насос.
Затем нажмите «Поток оболочки» и выберите «Пуск».Поместите сверхчистую воду на погрузочную платформу. Через четыре минуты нажмите «Образец и ускорение», а затем выберите «Выгрузить в образце». Через 30 секунд поместите заготовку на грузовую платформу.
Нажмите «Образец», выберите «Ускорение», а затем выберите «Выгрузить в образце». Затем поместите трубку со сверхчистой водой на погрузочную платформу. Одновременно нажмите «Сэмпл» и «Ускорение», а затем «Поток оболочки» и «Продувка».
Нажмите «Ручное управление» и поместите пробирку с концентрацией частиц на грузовую платформу. Затем нажмите «Образец», выберите «Ускорение» в течение одной минуты и одновременно выберите 250-нанометровый контроль качества стандартных флуоресцентных наносфер кремнезема в разделе «Информация об образце». Выберите «Отбор проб из образца» и включите детектор, нажав на SPCM.
Затем нажмите «Автоматическая выборка» и введите 1.0 в набор для отбора проб, чтобы зафиксировать давление на уровне одного килопаскаля. Нажмите на панель инструментов и выберите «Большой сигнал». Отрегулируйте горизонтальное положение лазера и установите лазер на два микрометра.
Затем непрерывно нажимайте на L и R, чтобы убедиться, что сигнал сильный и равномерный. Нажмите «Время записи», чтобы собрать данные, которые автоматически перейдут в буфер по завершении. Затем сохраните данные в файле Nfa и нажмите «Образец», чтобы выбрать «Выгрузить».
Поместите трубку с чистящим раствором на грузовую платформу. Нажмите «Образец», выберите «Ускорение» и через одну минуту нажмите «Образец и выгрузка». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
Поместите пробирку стандартного размера частиц на загрузочную платформу и нажмите «Повышение пробы» в течение одной минуты. Выберите контроль качества от 68 до 155 S16M-Exo в разделе «Информация об образце» и нажмите «Образец», затем «Выборка». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».
Нажмите «Время записи», чтобы собрать данные, которые автоматически перейдут в буфер по завершении. Затем сохраните данные в файле Nfa и нажмите «Образец», чтобы выбрать «Выгрузить». После удаления остатков с помощью чистящего раствора поместите трубку PBS на загрузочную платформу и выполните действия, показанные для стандартной пробирки с размером частиц.
Затем очистите наконечник капилляра, как показано ранее, и загрузите образец sEV для анализа данных, описанных ранее для стандартной пробирки с размером частиц. Очищенные sEV исследовали под просвечивающим электронным микроскопом, который выявил наличие sEV с чашеобразной морфологией. Проведена проточная цитометрия для sEV.
Причем размер частиц варьировался от 40 до 200 нанометров, а средний размер частиц составлял 89 нанометров. Было обнаружено, что чистота обогащенных sEV составляет 68,32%Белковые маркеры sEV, такие как CD63, CD9 и TSG101, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. GM130 использовался в качестве отрицательного контрольного маркера sEV, который был обнаружен в тканевых клетках, но не в sEV.
Крайне важно выполнять этапы ферментативного сбраживания, дифференциального ультрацентрифугирования и мембранной фильтрации с особой тщательностью, чтобы обеспечить чистоту небольших внеклеточных везикул.
