Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusundan türetilmiş küçük hücre dışı veziküllerin, klasik, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksek bir saflıkta izole edilmesine izin verir. Bu teknoloji basit, kullanışlı ve kullanımı kolaydır, bu da küçük hücre dışı veziküllerin incelenmesi için metodolojik destek sağlayabilir. Başlamak için, doku örneğini 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın.
Yaklaşık 400 miligram dokuyu buz kutusunun üzerindeki 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve dokuyu bir neşterle ince ince kıyın. Dokuyu 1.5 mililitre sindirim çözeltisi ile altı kuyucuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra, plakayı transfer renk açma çalkalayıcısına yerleştirin ve karaciğer kanseri dokusunun tamamen ayrışması ve küçük hücre dışı veziküllerin veya sEV'lerin salınması için 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, altı kuyucuklu plakayı buz kutusuna yerleştirin. Sindirimi durdurmak için 80 mikrolitre fosfataz inhibitörü ve 200 mikrolitre tam proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin. Ardından, sindirim çözeltisini iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın ve büyük doku kalıntılarını gidermek için yavaşça filtreleyin.
Küçük doku kalıntılarını gidermek için filtratı 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir iki mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın. Hücre kalıntılarını gidermek için süpernatantı 20 dakika boyunca 3.000 g'da santrifüj edin. Pipetin ucu alttaki beyaz döküntüye temas etmek üzere olana kadar süpernatantı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
Kalan sıvının santrifüjlemesini tekrarladıktan sonra, süpernatantı enkazı rahatsız etmeden tüpün içine toplayın. Toplanan süpernatantı 20 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüj edin ve süpernatantın 900 mikrolitresini 4.7 milimetrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Kalan sıvının santrifüjlemesini tekrarlayın ve ardından her iki süpernatantı da aynı ultrasantrifüj tüpünde toplayın ve karıştırın.
Tüpü tamamen PBS ile doldurun. Süpernatantı 60 dakika boyunca 100.000 g'da santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, ultrasantrifüj tüpünü PBS ile doldurarak pelet yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi 60 dakika boyunca 100.000 g'da tekrarladıktan sonra, peleti 50 mikrolitre PBS ile askıya alın. Bir mililitrelik steril bir şırınga kullanarak sEV süspansiyonunu aspire edin ve 0,22 mikrometrelik bir membran filtresinden 600 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Daha fazla analiz için filtratı 80 santigrat derecede saklayın.
sEV'lerin boyut dağılımını ve saflığını belirlemek için bir nanopartikül akış sitometresi kullanın. Temizleme çözeltisinin hacmini kontrol edin. Ardından, kılıf seviyeleri ile atık sıvı arasındaki farkı not edin.
Cihazın ana güç kaynağını açtıktan 20 saniye sonra bilgisayarı açın. Yazılımı çalıştırmak için cihazın düzgün bağlandığını gösteren bip seslerini bekleyin. Kamerayı, lazeri ve hava pompasını açmak için Başlat'a tıklayın.
Ardından, Sheath Flow'a tıklayın ve Start Up'ı seçin.Yükleme platformuna ultra saf su yerleştirin. Dört dakika sonra Numune ve Güçlendirme'ye tıklayın ve ardından Örnek'te Boşalt'ı seçin. 30 saniye sonra, boş tüpü yükleme platformuna yerleştirin.
Örnek'e tıklayın, Öne Çıkarma'yı seçin ve ardından Örnek'te Boşalt'ı seçin. Ardından, ultra saf su içeren tüpü yükleme platformuna yerleştirin. Aynı anda, Numune ve Artırma'ya, ardından Kılıf Akışı ve Temizleme'ye tıklayın.
Manuel Çalışma'ya tıklayın ve partikül konsantrasyon tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Ardından, Numune'ye tıklayın, bir dakika boyunca Güçlendirme'yi seçin ve aynı anda Numune Bilgileri'nde 250 nanometre Standart Floresan Silika Nanospheres kalite kontrolünü seçin. Numuneden Örnekleme'yi seçin ve SPCM'ye tıklayarak dedektörü açın.
Ardından, Otomatik Örnekleme'ye tıklayın ve basıncı bir kilopaskalda sabitlemek için Örnekleme Kümesi'ne 1.0 girin. Araç çubuğuna tıklayın ve Büyük Sinyal'i seçin. Lazerin yatay konumunu ayarlayın ve lazeri iki mikrometreye ayarlayın.
Ardından, sinyalin güçlü ve düzgün olduğundan emin olmak için sürekli olarak L ve R'ye tıklayın. İşiniz bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri Nfa Dosyasına kaydedin ve Kaldır'ı seçmek için Örnek'e tıklayın.
Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Örnekle'ye tıklayın, Öne Çıkarma'yı seçin ve bir dakika sonra Örnekle ve Boşalt'a tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.
Partikül boyutu standart tüpünü yükleme platformuna yerleştirin ve bir dakika boyunca Numune Artırma'ya tıklayın. Numune Bilgileri'nde 68 - 155 S16M-Exo kalite kontrolünü seçin ve Numune'ye ve ardından Örnekleme'ye tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.
İşiniz bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Nfa dosyasına kaydedin ve Kaldır'ı seçmek için Örnek'e tıklayın. Kalıntıları temizleme çözeltisi ile çıkardıktan sonra, PBS tüpünü yükleme platformuna yerleştirin ve partikül boyutu standart tüp için gösterilen adımları uygulayın.
Ardından, kılcal ucu daha önce gösterildiği gibi temizleyin ve parçacık boyutu standart tüp için daha önce açıklanan verileri analiz etmek için sEV örneğini yükleyin. Saflaştırılmış sEV'ler, fincan şeklinde bir morfolojiye sahip sEV'lerin varlığını ortaya çıkaran bir transmisyon elektron mikroskobu altında incelendi. sEV'ler için akım sitometrisi yapıldı.
Ve parçacık boyutu 40 ila 200 nanometre arasında değişiyordu ve ortalama parçacık boyutu 89 nanometre idi. Zenginleştirilmiş sEV'lerin saflığı %68.32 olarak bulunduCD63, CD9 ve TSG101 gibi sEV'lerin protein belirteçleri western blot ile tespit edildi. GM130, doku hücrelerinde bulunan ancak sEV'lerde bulunmayan sEV'lerin negatif kontrol belirteci olarak kullanıldı.
Küçük hücre dışı veziküllerin saflığını sağlamak için enzimatik sindirim, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve membran filtrasyonu adımlarını büyük bir özenle gerçekleştirmek çok önemlidir.
