Diese Methode ermöglicht die Isolierung von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Leberkrebsgewebe mit einer höheren Reinheit als die klassische, differentielle Ultrazentrifugation. Diese Technologie ist einfach, bequem und leicht zu bedienen und kann methodische Unterstützung für die Untersuchung kleiner extrazellulärer Vesikel bieten. Nehmen Sie zunächst die Gewebeprobe aus dem 80-Grad-Celsius-Gefrierschrank.
Geben Sie etwa 400 Milligramm des Gewebes in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale auf die Eisbox und zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Skalpell fein. Übertragen Sie das Gewebe auf eine Platte mit sechs Vertiefungen mit 1,5 Millilitern der Verdauungslösung. Legen Sie dann die Platte auf den Übertragungsentfärbungsschüttler und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das Leberkrebsgewebe vollständig zu dissoziieren und die kleinen extrazellulären Vesikel oder sEVs freizusetzen.
Legen Sie die Sechs-Well-Platte nach der Inkubation auf die Eisbox. Fügen Sie 80 Mikroliter Phosphatase-Inhibitor und 200 Mikroliter vollständige Proteasehemmer-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Übertragen Sie dann die Verdauungslösung in ein 70-Mikrometer-Zellsieb, das auf einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist, und filtern Sie es langsam, um große Gewebereste zu entfernen.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 g für 10 Minuten, um die kleinen Gewebereste zu entfernen, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.000 g für 20 Minuten, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, bis die Spitze der Pipette die weißen Rückstände am Boden berührt.
Nach wiederholter Zentrifugation der restlichen Flüssigkeit den Überstand in das Röhrchen geben, ohne den Schmutz zu stören. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 12.000 g für 20 Minuten und überführen Sie 900 Mikroliter des Überstands in ein 4,7-Millimeter-Ultrazentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation der verbleibenden Flüssigkeit und sammeln und mischen Sie dann beide Überstände in demselben Ultrazentrifugenröhrchen.
Füllen Sie das Röhrchen vollständig mit PBS. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 g für 60 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit PBS füllen.
Nachdem Sie die Zentrifugation bei 100.000 g für 60 Minuten wiederholt haben, resuspendieren Sie das Pellet mit 50 Mikrolitern PBS. Saugen Sie die sEV-Suspension mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze ab und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter in ein 600-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie das Filtrat zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius.
Verwenden Sie ein Nanopartikel-Durchflusszytometer, um die Größenverteilung und Reinheit der sEVs zu bestimmen. Überprüfen Sie das Volumen der Reinigungslösung. Beachten Sie dann den Unterschied zwischen den Füllständen der Hülle und der Abfallflüssigkeit.
Schalten Sie nach 20 Sekunden Einschalten der Hauptstromversorgung des Instruments den Computer ein. Warten Sie, bis die Signaltöne anzeigen, dass das Gerät ordnungsgemäß angeschlossen ist, um die Software auszuführen. Klicken Sie auf Start, um die Kamera, den Laser und die Luftpumpe einzuschalten.
Klicken Sie anschließend auf Sheath Flow und wählen Sie Start Up.Stellen Sie Reinstwasser auf die Ladefläche. Klicken Sie nach vier Minuten auf Sample und Boosting und wählen Sie dann In Sample entladen aus. Legen Sie das leere Rohr nach 30 Sekunden auf die Ladefläche.
Klicken Sie auf Sample, wählen Sie Boosting und dann In Sample entladen aus. Stellen Sie dann das Rohr mit dem Reinstwasser auf die Ladefläche. Klicken Sie gleichzeitig auf Sample und Boosting, gefolgt von Sheath Flow und Purge.
Klicken Sie auf Manuelle Bedienung und stellen Sie das Partikelkonzentrationsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie dann auf Probe, wählen Sie Boosting für eine Minute und wählen Sie gleichzeitig die Qualitätskontrolle von 250-Nanometer-Standard-Fluoreszenz-Siliziumdioxid-Nanokugeln in den Probeninformationen. Wählen Sie Probenahme aus Probe und schalten Sie den Detektor ein, indem Sie auf SPCM klicken.
Klicken Sie dann auf Auto Sampling und geben Sie 1.0 in Sampling Set ein, um den Druck auf ein Kilopascal zu fixieren. Klicken Sie auf die Symbolleiste und wählen Sie Großes Signal. Stellen Sie die horizontale Position des Lasers ein und stellen Sie den Laser auf zwei Mikrometer ein.
Klicken Sie dann kontinuierlich auf L und R, um sicherzustellen, dass das Signal stark und gleichmäßig ist. Klicken Sie auf Time to Record, um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in der Nfa-Datei und klicken Sie auf Beispiel, um Entladen auszuwählen.
Stellen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie auf Sample, wählen Sie Boosting und klicken Sie nach einer Minute auf Sample and Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.
Stellen Sie das Standardröhrchen mit Partikelgröße auf die Ladeplattform und klicken Sie eine Minute lang auf Sample Boosting. Wählen Sie 68 bis 155 S16M-Exo-Qualitätskontrolle unter Probeninformationen aus und klicken Sie auf Probe und dann auf Probenahme. Klicken Sie anschließend auf die Symbolleiste und wählen Sie Small Signal.
Klicken Sie auf Time to Record, um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Nfa-Datei und klicken Sie auf Beispiel, um Entladen auszuwählen. Nachdem Sie die Rückstände mit der Reinigungslösung entfernt haben, legen Sie das PBS-Rohr auf die Ladefläche und führen Sie die für das Standardrohr mit Partikelgröße gezeigten Schritte aus.
Reinigen Sie als Nächstes die Kapillarspitze, wie zuvor gezeigt, und laden Sie die sEV-Probe, um die zuvor beschriebenen Daten für das Standardröhrchen mit Partikelgröße zu analysieren. Die gereinigten sEVs wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht, das das Vorhandensein von sEVs mit einer becherförmigen Morphologie zeigte. Es wurde eine Durchflusszytometrie für die sEVs durchgeführt.
Und die Partikelgröße reichte von 40 bis 200 Nanometern, und die durchschnittliche Partikelgröße betrug 89 Nanometer. Die Reinheit der angereicherten sEVs betrug 68,32%Die Proteinmarker von sEVs wie CD63, CD9 und TSG101 wurden durch Western Blot nachgewiesen. GM130 wurde als Negativkontrollmarker für sEVs verwendet, der in Gewebezellen, aber nicht in den sEVs gefunden wurde.
Es ist von entscheidender Bedeutung, die Schritte des enzymatischen Aufschlusses, der differentiellen Ultrazentrifugation und der Membranfiltration mit größter Sorgfalt durchzuführen, um die Reinheit kleiner extrazellulärer Vesikel zu gewährleisten.
