Este método permite o isolamento de pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido do câncer de fígado com uma pureza maior do que a alcançada pela ultracentrifugação diferencial clássica. Essa tecnologia é simples, conveniente e de fácil operação, podendo fornecer suporte metodológico para o estudo de pequenas vesículas extracelulares. Para começar, retire a amostra de tecido do congelador de 80 graus Celsius.
Coloque aproximadamente 400 miligramas do tecido em uma placa de cultura de células de 10 centímetros na caixa de gelo e pique finamente o tecido com um bisturi. Transfira o tecido para uma placa de seis poços com 1,5 mililitros da solução digestiva. Em seguida, coloque a placa no agitador descolorante de transferência e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos para dissociação completa do tecido do câncer de fígado e liberação das pequenas vesículas extracelulares, ou sEVs.
Após a incubação, coloque a placa de seis poços na caixa de gelo. Adicione 80 microlitros de inibidor de fosfatase e 200 microlitros de solução completa de inibidor de protease para parar a digestão. Em seguida, transfira a solução digestiva para um filtro de células de 70 micrômetros colocado em um tubo de centrífuga de dois mililitros e filtre-o lentamente para remover quaisquer grandes detritos de tecido.
Centrifugar o filtrado a 500 g por 10 minutos para remover os pequenos detritos de tecido e coletar o sobrenadante em um novo tubo centrífugo de dois mililitros. Centrifugar o sobrenadante a 3.000 g durante 20 minutos para remover os restos celulares. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga até que a ponta da pipeta esteja prestes a tocar os detritos brancos na parte inferior.
Depois de repetir a centrifugação do líquido restante, coloque o sobrenadante no tubo sem perturbar os detritos. Centrifugar o sobrenadante coletado a 12.000 g por 20 minutos e transferir 900 microlitros do sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 4,7 milímetros. Repita a centrifugação do líquido restante e, em seguida, colete e misture ambos os sobrenadantes no mesmo tubo de ultracentrífuga.
Encha o tubo completamente com PBS. Centrifugar o sobrenadante a 100.000 g durante 60 minutos. Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet enchendo o tubo ultracentrífugo com PBS.
Após repetir a centrifugação a 100.000 g por 60 minutos, ressuspenda o pellet com 50 microlitros de PBS. Aspirar a suspensão de sEV usando uma seringa estéril de um mililitro e filtrá-la através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetro em um tubo centrífugo de 600 microlitros. Conservar o filtrado a 80 graus Celsius para análise posterior.
Use um citômetro de fluxo de nanopartículas para determinar a distribuição de tamanho e pureza dos sEVs. Verifique o volume da solução de limpeza. Em seguida, observe a diferença entre os níveis da bainha e o líquido residual.
Após 20 segundos de ligar a fonte de alimentação principal do instrumento, ligue o computador. Aguarde os bipes indicando que o instrumento está conectado corretamente para executar o software. Clique em Iniciar para ligar a câmera, o laser e a bomba de ar.
Em seguida, clique em Fluxo de bainha e selecione Iniciar.Coloque água ultrapura na plataforma de carregamento. Após quatro minutos, clique em Amostra e Impulsionamento e, em seguida, selecione Descarregar na Amostra. Após 30 segundos, coloque o tubo em branco na plataforma de carregamento.
Clique em Amostra, selecione Aumentar e, em seguida, selecione Descarregar na amostra. Em seguida, coloque o tubo contendo a água ultrapura na plataforma de carregamento. Simultaneamente, clique em Sample and Boosting, seguido por Sheath Flow e Purge.
Clique em Operação Manual e coloque o tubo de concentração de partículas na plataforma de carregamento. Em seguida, clique em Amostra, selecione Impulsionando por um minuto e, simultaneamente, selecione o controle de qualidade de nanoesferas de sílica fluorescente padrão de 250 nanômetros em Informações da amostra. Selecione Amostragem da amostra e ligue o detector clicando em SPCM.
Em seguida, clique em Auto Sampling e insira 1.0 em Sampling Set para fixar a pressão em um kilopascal. Clique na barra de ferramentas e selecione Sinal grande. Ajuste a posição horizontal do laser e ajuste o laser para dois micrômetros.
Em seguida, clique continuamente em L e R para garantir que o sinal seja forte e uniforme. Clique em Time to Record para coletar os dados, que salta automaticamente para Buffer quando terminar. Em seguida, salve os dados no arquivo Nfa e clique em Amostra para selecionar Descarregar.
Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carga. Clique em Amostra, selecione Impulsionar e, após um minuto, clique em Amostra e Descarregar. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
Coloque o tubo padrão de tamanho de partícula na plataforma de carregamento e clique em Aumento de amostra por um minuto. Selecione 68 a 155 controle de qualidade S16M-Exo em Informações da amostra e clique em Amostra e, em seguida, em Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.
Clique em Time to Record para coletar os dados, que salta automaticamente para Buffer quando terminar. Em seguida, salve os dados em um arquivo Nfa e clique em Amostra para selecionar Descarregar. Após a remoção dos resíduos com a solução de limpeza, coloque o tubo PBS na plataforma de carregamento e execute as etapas demonstradas para o tubo padrão de tamanho de partícula.
Em seguida, limpe a ponta capilar, como demonstrado anteriormente, e carregue a amostra de sEV para analisar os dados descritos anteriormente para o tubo padrão de tamanho de partícula. Os sEVs purificados foram examinados em microscópio eletrônico de transmissão, que revelou a presença de sEVs com morfologia em forma de taça. Foi realizada citometria de fluxo para os sEVs.
E o tamanho das partículas variava de 40 a 200 nanômetros, e o tamanho médio das partículas era de 89 nanômetros. A pureza dos sEVs enriquecidos foi encontrada para ser 68,32%Os marcadores proteicos de sEVs tais como CD63, CD9, e TSG101 foram detectados por western blot. GM130 foi usado como marcador de controle negativo de sEVs, que foi encontrado em células teciduais, mas não nos sEVs.
É crucial realizar as etapas de digestão enzimática, ultracentrifugação diferencial e filtração por membrana com o máximo cuidado para garantir a pureza de pequenas vesículas extracelulares.
