Este método permite el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado con una pureza superior a la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Esta tecnología es simple, conveniente y fácil de operar, lo que puede proporcionar soporte metodológico para el estudio de pequeñas vesículas extracelulares. Para comenzar, retire la muestra de tejido del congelador a 80 grados centígrados.
Coloque aproximadamente 400 miligramos del tejido en un plato de cultivo celular de 10 centímetros en la caja de hielo y pique finamente el tejido con un bisturí. Transfiera el tejido a una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de la solución digestiva. Luego, coloque la placa en el agitador de decoloración de transferencia e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos para la disociación completa del tejido del cáncer de hígado y la liberación de las pequeñas vesículas extracelulares, o sEV.
Después de la incubación, coloque la placa de seis pocillos en la caja de hielo. Agregue 80 microlitros de inhibidor de fosfatasa y 200 microlitros de solución completa de inhibidor de proteasa para detener la digestión. Luego, transfiera la solución digestiva a un colador de células de 70 micrómetros colocado en un tubo de centrífuga de dos mililitros y fílelo lentamente para eliminar cualquier residuo de tejido grande.
Centrifugar el filtrado a 500 g durante 10 minutos para eliminar los restos de tejido pequeño y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de dos mililitros. Centrifugar el sobrenadante a 3, 000 g durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga hasta que la punta de la pipeta esté a punto de tocar los residuos blancos en la parte inferior.
Después de repetir la centrifugación del líquido restante, agrupe el sobrenadante en el tubo sin perturbar los desechos. Centrifugar el sobrenadante recogido a 12.000 g durante 20 minutos y transferir 900 microlitros del sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 4,7 milímetros. Repita la centrifugación del líquido restante, y luego recoja y mezcle ambos sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga.
Llene el tubo completamente con PBS. Centrifugar el sobrenadante a 100, 000 g durante 60 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet llenando el tubo de ultracentrífuga con PBS.
Después de repetir la centrifugación a 100, 000 g durante 60 minutos, vuelva a suspender el pellet con 50 microlitros de PBS. Aspire la suspensión sEV con una jeringa estéril de un mililitro y fíjela a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros en un tubo de centrífuga de 600 microlitros. Almacene el filtrado a 80 grados centígrados para su posterior análisis.
Utilice un citómetro de flujo de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la pureza de los sEV. Compruebe el volumen de la solución de limpieza. Luego, observe la diferencia entre los niveles de la vaina y el líquido residual.
Después de 20 segundos de encender la fuente de alimentación principal del instrumento, encienda la computadora. Espere a que aparezcan los pitidos que indican que el instrumento está conectado correctamente para ejecutar el software. Haga clic en Iniciar para encender la cámara, el láser y la bomba de aire.
A continuación, haga clic en Sheath Flow y seleccione Start Up.Coloque agua ultrapura en la plataforma de carga. Después de cuatro minutos, haga clic en Muestra y potenciación, y luego seleccione Descargar en muestra. Después de 30 segundos, coloque el tubo en blanco en la plataforma de carga.
Haga clic en Muestra, seleccione Aumentar y, a continuación, seleccione Descargar en muestra. Luego, coloque el tubo que contiene el agua ultrapura en la plataforma de carga. Simultáneamente, haga clic en Muestra y Potenciador, seguido de Flujo de vaina y Purga.
Haga clic en Operación manual y coloque el tubo de concentración de partículas en la plataforma de carga. Luego, haga clic en Muestra, seleccione Boosting durante un minuto y seleccione simultáneamente el control de calidad de 250 nanómetros Standard Fluorescent Silica Nanospheres en Información de muestra. Seleccione Muestreo de muestra y encienda el detector haciendo clic en SPCM.
Luego, haga clic en Muestreo automático e ingrese 1.0 en Conjunto de muestreo para fijar la presión a un kilopascale. Haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal grande. Ajuste la posición horizontal del láser y ajuste el láser a dos micrómetros.
Luego, haga clic continuamente en L y R para asegurarse de que la señal sea fuerte y uniforme. Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en Archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar.
Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga. Haga clic en Muestra, seleccione Boosting y, después de un minuto, haga clic en Sample and Unload. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.
Coloque el tubo estándar de tamaño de partícula en la plataforma de carga y haga clic en Sample Boosting durante un minuto. Seleccione 68 a 155 Control de calidad S16M-Exo en Información de muestra, haga clic en Muestra y, a continuación, en Muestreo. A continuación, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.
Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en un archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar. Después de eliminar los residuos con la solución de limpieza, coloque el tubo PBS en la plataforma de carga y realice los pasos demostrados para el tubo estándar de tamaño de partícula.
A continuación, limpie la punta capilar como se demostró anteriormente y cargue la muestra de sEV para analizar los datos descritos anteriormente para el tubo estándar de tamaño de partícula. Los sEV purificados se examinaron bajo un microscopio electrónico de transmisión, que reveló la presencia de sEV con una morfología en forma de copa. Se realizó citometría de flujo para los sEVs.
Y el tamaño de partícula varió de 40 a 200 nanómetros, y el tamaño promedio de partícula fue de 89 nanómetros. Se encontró que la pureza de los sEV enriquecidos era del 68,32%Los marcadores proteicos de sEV como CD63, CD9 y TSG101 fueron detectados por Western blot. GM130 se utilizó como marcador de control negativo de sEV, que se encontró en las células de tejido pero no en los sEV.
Es crucial realizar los pasos de digestión enzimática, ultracentrifugación diferencial y filtración de membrana con el máximo cuidado para garantizar la pureza de pequeñas vesículas extracelulares.
