大肠杆菌中天然偶联质粒介导的水平基因转移检测

像大肠杆菌这样的细菌在结合质粒中携带抗生素抗性基因。这种细菌可以在医院中找到，在动物和水生环境中作为共生动物生活。天然偶联质粒在不同细菌谱系之间水平转移基因。

我们介绍了用于检测共轭质粒和形成偶联效率的金属。这种技术简单而灵敏。它很敏感，因为它使用质粒、供体和受体的标记。

这些标记是可选择的，这意味着它们可以识别非常大的人群中的单个事件。我们提出的方案有助于研究抗生素耐药性的演变和流行病学监测，即监测耐药基因的流动。演示该程序的将是我实验室的博士生Caison Warner和CAMS实验室的本科生Pepper St.Clair。

在第一天，分别将供体和受体从甘油原液中划线在培养基C上，这是不含抗生素的麦康基琼脂，并在37摄氏度下孵育过夜。在第二天，为每个供体和受体标记一个14毫升的培养管。选择每个供体和受体的单个菌落，并在两毫升穆勒辛顿肉汤中以 200 RPM 在 37 摄氏度下生长 18 小时。

在第三天，测量10倍盐水稀释过夜生长培养物的光密度，在600纳米下不涡旋。如果需要，使用无菌盐水溶液将光密度调节到两个。将1.5毫升微量离心管标记为配对管，指示供体和受体菌株。

将每个供体和受体的500微升调整后的悬浮液转移到交配管中，并通过倒置轻轻混合悬浮液。在室温下以500G离心配合管10分钟.从配合管中移出800微升上清液而不干扰沉淀，在管中留下200微升。将交配管在 37 摄氏度下孵育 18 小时。

此外，作为阴性对照，在培养基B上划线供体和培养基A上的受体的过夜培养物，并将平板在37摄氏度下孵育过夜。孵育后，在第四个天，向交配管中加入800微升盐溶液，并通过涡旋重悬。对配合悬浮液进行连续稀释，并在培养基板上添加100微升每种稀释液。

板干燥后，在 37 摄氏度下孵育 18 小时，并计算每个供体或每个受体的缀合频率，如手稿中所述。使用简单的煮沸制备提取方法从细菌细胞壁中提取DNA后，将1.5毫升管标记为所需PCR管中的池，并注明基因和样品的名称。在标记为池的试管中，加入无菌水、PCR 预混液、引物和聚合酶。

在冷藏环境中上下移液至少 10 次，轻轻混合。将模板DNA添加到相应的管中，并用盖子固定PCR管。将PCR管放入热循环仪中，并启动手稿中所述的抗性基因和复制子程序。

为了确认扩增子，通过在250毫升烧瓶中加入琼脂糖和TAE缓冲液来制备1%琼脂糖凝胶，并使用微波炉融化琼脂糖。琼脂糖溶液冷却至约55摄氏度后，在通风橱下加入6微升SYBR Green并混合。将凝胶倒入用胶带密封的托盘中，以避免溢出，并让凝胶凝固 15 到 25 分钟，直到出现浑浊。

取下胶带后，将凝胶放入电泳室中，并加入TAE缓冲液以覆盖凝胶。通过上下移液至少10次，将5微升六倍DNA凝胶上样染料与每次反应的25微升混合。然后通过避免气泡将混合物装入孔中。

将四微升一千碱基对DNA分子量标准品加入第一个孔后，关闭室盖并在120伏和400毫安下运行凝胶60分钟。在紫外光下可视化凝胶并记录图像。MacConkey琼脂将产生大粉红色菌落的乳糖阳性供体与产生大粉红色菌落的乳糖阳性供体和转缀物区分开来，后者是乳糖阴性的，产生较小的淡黄色菌落。

供体菌株SSW4955的五种偶联效率均在同一数量级内，表明无论用于转缀鉴定的选择如何，都可以检测到偶联质粒的动员。而供体菌株SSW7037的偶联效率低三倍，这允许比较不同供体和质粒类型与相同受体的偶联效率。PCR产物的凝胶电泳证实了转缀物中存在预期的重复子。

该测定完全取决于可选择的标记物。必须有适当的对照来确认每个选择是否有效，并且需要通过比色法或通过PCR确认转缀物。这里介绍的方案可以适用于体内偶联或生物膜模型的研究，以及研究调节偶联效率的变量。

这种大规模检测可移动质粒的方案将大大增加我们对基因在环境中流动的理解，并研究影响偶联效率的变量。