대장균과 같은 박테리아는 접합 플라스미드에서 항생제 내성 유전자를 가지고 있습니다. 이 박테리아는 병원, 동물 및 수생 환경에서 공생으로 살 수 있습니다. 천연 접합 플라스미드는 서로 다른 박테리아 계통 사이에서 유전자를 수평적으로 전달합니다.
우리는 접합 플라스미드 및 형성 접합 효율의 검출을 위한 금속을 제시합니다. 이 기술은 간단하고 민감합니다. 플라스미드, 기증자 및 수혜자에 대한 마커를 사용하기 때문에 민감합니다.
이러한 마커는 선택 가능하며, 이는 매우 큰 모집단에서 단일 이벤트를 식별할 수 있음을 의미합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 항생제 내성의 진화를 연구하고 역학 감시, 즉 약물 내성 유전자의 흐름을 모니터링하는 데 유용합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Caison Warner와 CAMS 연구실의 학부생 인 Pepper St.Clair가 될 것입니다.
첫째 날에는 항생제가 없는 MacConkey 한천인 배지 C에 글리세롤 스톡의 기증자와 수혜자를 별도로 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 둘째 날에는 각 기증자와 수혜자에 대해 14밀리리터 배양 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 기증자와 수혜자의 단일 콜로니를 선택하고 섭씨 37도에서 18시간 동안 200RPM의 Mueller Hinton Broth 2밀리리터에서 재배합니다.
3일째에, 식염수의 10배 희석된 배양물을 볼텍싱 없이 600 나노미터에서 하룻밤 동안 배양하여 광학 밀도를 측정하였다. 필요한 경우 멸균된 식염수를 사용하여 광학 밀도를 2로 조정합니다. 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브를 짝짓기 튜브로 표시하여 기증자와 수혜자 균주를 표시합니다.
각 기증자와 수혜자의 조정된 현탁액 500 마이크로리터를 짝짓기 튜브에 옮기고 현탁액을 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 500G에서 실온에서 10분 동안 결합 튜브를 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 결합 튜브에서 800마이크로리터의 상청액을 피펫팅하고 튜브에 200마이크로리터를 남깁니다. 섭씨 37도에서 18시간 동안 짝짓기 튜브를 배양합니다.
또한, 음성 대조군으로서 배지 B의 기증자와 배지 A의 수혜자의 하룻밤 배양을 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 4일째에 800마이크로리터의 식염수를 짝짓기 튜브에 넣고 볼텍싱에 의해 재현탁합니다. 짝짓기 현탁액을 연속적으로 희석하고 각 희석액 100 마이크로 리터를 배지 플레이트에 첨가하십시오.
플레이트가 건조되면 섭씨 37도에서 18시간 동안 배양하고 원고에 설명된 대로 기증자 또는 수혜자당 접합 빈도를 계산합니다. 간단한 끓임 준비 추출 방법을 사용하여 박테리아 세포벽에서 DNA를 추출한 후 1.5밀리리터 튜브를 유전자 및 샘플의 이름과 함께 필요한 PCR 튜브의 풀로 표시합니다. 풀이라고 표시된 튜브에 멸균수, PCR 마스터 믹스, 프라이머 및 중합효소를 추가합니다.
차가운 환경에서 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하십시오. 해당 튜브에 템플릿 DNA를 추가하고 PCR 튜브를 캡으로 고정합니다. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 원고에 설명된 대로 내성 유전자 및 레플리콘에 대한 프로그램을 시작합니다.
앰플리콘 확인을 위해, 250 밀리리터 플라스크에 아가로스와 TAE 완충액을 첨가하여 1%아가로스 겔을 제조하고, 마이크로웨이브를 이용하여 아가로스를 녹인다. 아가로스 용액이 약 섭씨 55도까지 냉각되면, 흄 후드 아래에서, 6 마이크로리터의 SYBR 그린을 첨가하고 혼합한다. 엎지르지 않도록 접착 테이프로 밀봉된 트레이에 젤을 붓고 탁도가 나타날 때까지 젤을 15-25분 동안 그대로 둡니다.
접착 테이프를 제거한 후 겔을 전기 영동 챔버에 넣고 TAE 버퍼를 첨가하여 겔을 덮습니다. 6배 DNA 겔 로딩 염료 5마이크로리터를 각 반응물 25마이크로리터와 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 거품을 피하여 혼합물을 우물에 넣으십시오.
4 마이크로리터의 1킬로염기쌍 DNA 래더를 제1 웰에 첨가한 후, 챔버 뚜껑을 닫고 120 볼트 및 400 밀리암페어에서 60 분 동안 겔을 작동시킨다. 자외선 아래에서 젤을 시각화하고 이미지를 기록합니다. MacConkey 한천은 큰 분홍색 콜로니를 생성하는 유당 양성 기증자와 유당 음성이고 더 작은 옅은 노란색 콜로니를 생성하는 수혜자 및 transconjugants를 구별했습니다.
공여체 균주 SSW4955의 5가지 접합 효율은 모두 동일한 크기 차수 내에 있었으며, 이는 접합 플라스미드의 동원이 형질접합체 식별에 사용된 선택에 관계없이 검출될 수 있음을 나타냅니다. 반면 공여체 균주 SSW7037은 접합 효율이 3배 더 낮은 것으로 나타났으며, 이를 통해 동일한 수용자와 서로 다른 공여체 및 플라스미드 유형의 접합 효율을 비교할 수 있습니다. PCR 산물의 겔 전기영동은 transconjugants에서 예상되는 replicon의 존재를 확인했습니다.
이 분석은 선택 가능한 마커에 전적으로 의존합니다. 각 선택이 작동하는지 확인하기 위한 제어가 있어야 하며 transconjugants는 비색계 또는 PCR로 확인해야 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 내 접합 또는 생물막 모델 연구 및 접합 효율을 조절하는 변수 연구에 적용할 수 있습니다.
대규모로 동원 가능한 플라스미드를 검출하기 위한 이 프로토콜은 환경 전반에 걸친 유전자의 흐름에 대한 우리의 이해와 접합의 효율성에 영향을 미치는 변수를 연구하는 데 크게 도움이 될 것입니다.
