Batteri come E.coli trasportano geni resistenti agli antibiotici nei plasmidi coniugativi. Questo batterio può essere trovato negli ospedali, vivendo come commensali negli animali e negli ambienti acquatici. Plasmidi coniugativi naturali trasferimento orizzontale di geni tra diverse linee batteriche.
Presentiamo metalli per la rilevazione di plasmidi coniugativi e l'efficienza di coniugazione della formazione. Questa tecnica è semplice e sensibile. È sensibile perché utilizza marcatori per il plasmide, il donatore e il ricevente.
Questi marcatori sono selezionabili, il che significa che possono identificare singoli eventi in popolazioni molto grandi. I protocolli che presentiamo sono utili per studiare l'evoluzione della resistenza agli antibiotici e per la sorveglianza epidemiologica, cioè per monitorare il flusso di geni farmaco-resistenti. A dimostrare la procedura saranno Caison Warner, uno studente di dottorato del mio laboratorio, e Pepper St.Clair, uno studente universitario del laboratorio CAMS.
Il primo giorno, striare separatamente i donatori e il ricevente dalle scorte di glicerolo sul supporto C che è MacConkey agar senza antibiotici e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno, etichettare un tubo di coltura da 14 millilitri per ciascun donatore e ricevente. Seleziona una singola colonia di ciascun donatore e ricevente e coltivali in due millilitri di brodo Mueller Hinton a 200 giri / min per 18 ore a 37 gradi Celsius.
Il terzo giorno, misurare la densità ottica di 10 volte la coltura salina diluita durante la notte a 600 nanometri senza vortice. Se necessario, utilizzare una soluzione salina sterilizzata per regolare la densità ottica a due. Etichettare un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri come tubo di accoppiamento, indicando i ceppi del donatore e del ricevente.
Trasferire 500 microlitri della sospensione regolata di ciascun donatore e ricevente nel tubo di accoppiamento e mescolare delicatamente la sospensione per inversione. Centrifugare il tubo di accoppiamento a temperatura ambiente per 10 minuti a 500 G.Pipettare 800 microlitri di surnatante dal tubo di accoppiamento senza disturbare il pellet, lasciando 200 microlitri nel tubo. Incubare il tubo di accoppiamento per 18 ore a 37 gradi Celsius.
Inoltre, come controllo negativo, striscia la coltura notturna dei donatori sul media B e dei riceventi sul media A e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, il quarto giorno, aggiungere 800 microlitri di soluzione salina al tubo di accoppiamento e risospendere per vortexing. Effettuare diluizioni seriali della sospensione di accoppiamento e aggiungere 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di supporto.
Una volta asciugate le lastre, incubarle per 18 ore a 37 gradi Celsius e calcolare la frequenza di coniugazione per donatore o per ricevente come descritto nel manoscritto. Dopo aver estratto il DNA dalle pareti cellulari batteriche utilizzando un semplice metodo di estrazione con ebollizione, etichettare un tubo da 1,5 millilitri come pool nelle provette PCR richieste con il nome del gene e del campione. Nel tubo etichettato come piscina, aggiungere acqua sterile, master mix PCR, primer e polimerasi.
Mescolare delicatamente pipettando su e giù almeno 10 volte in un ambiente refrigerato. Aggiungere il DNA modello al tubo corrispondente e fissare i tubi PCR con tappi. Inserire i tubi PCR nel termociclatore e avviare il programma per i geni di resistenza e i replicons come descritto nel manoscritto.
Per la conferma dell'amplicone, preparare un gel di agarosio all'1% aggiungendo agarosio e tampone TAE in un pallone da 250 millilitri e sciogliere l'agarosio usando un forno a microonde. Una volta che la soluzione di agarosio si è raffreddata a circa 55 gradi Celsius, sotto una cappa aspirante, aggiungere sei microlitri di SYBR Green e mescolare. Versare il gel in un vassoio sigillato con nastro adesivo per evitare fuoriuscite e lasciare che il gel si fissi per 15-25 minuti fino a quando non appare la torbidità.
Dopo aver rimosso il nastro adesivo, posizionare il gel nella camera di elettroforesi e aggiungere tampone TAE per coprire il gel. Mescolare cinque microlitri di colorante caricante gel di DNA sei volte con 25 microlitri di ciascuna reazione pipettando su e giù almeno 10 volte. Quindi caricare la miscela nei pozzetti evitando le bolle.
Dopo aver aggiunto quattro microlitri di una scala di DNA a coppia di kilobase nel primo pozzetto, chiudere il coperchio della camera e far funzionare il gel per 60 minuti a 120 volt e 400 milliampere. Visualizza il gel sotto la luce UV e registra l'immagine. L'agar MacConkey distingueva i donatori positivi al lattosio che producevano grandi colonie rosa dal ricevente e dai transconiuganti, che erano negativi al lattosio e producevano colonie giallo pallido più piccole.
Le cinque efficienze di coniugazione di un ceppo donatore SSW4955 erano tutte all'interno dello stesso ordine di grandezza, indicando che la mobilizzazione del plasmide coniugativo può essere rilevata indipendentemente dalla selezione utilizzata per l'identificazione transconiugante. Mentre il ceppo donatore SSW7037 ha mostrato un'efficienza di coniugazione tre volte inferiore, che consente il confronto delle efficienze di coniugazione di diversi donatori e tipi di plasmidi con gli stessi riceventi. L'elettroforesi su gel dei prodotti PCR ha confermato la presenza di replicons attesi nei transconiuganti.
Questo test dipende completamente da marcatori selezionabili. Devono essere in atto controlli per confermare che ogni selezione funzioni e che i transconiuganti debbano essere confermati colorimetricamente o mediante PCR. I protocolli qui presentati possono essere adattati per lo studio di modelli di coniugazione in vivo o biofilm, e per lo studio di variabili che modulano l'efficienza di coniugazione.
Questo protocollo per rilevare plasmidi mobilizzabili su larga scala contribuirà notevolmente alla nostra comprensione del flusso di geni attraverso l'ambiente e allo studio delle variabili che influenzano l'efficienza della coniugazione.
