Bakterien wie E. coli tragen antibiotikaresistente Gene in konjugativen Plasmiden. Diese Bakterien können in Krankenhäusern, als Kommensalen in Tieren und in Gewässern gefunden werden. Natürliche konjugative Plasmide horizontaler Transfer von Genen zwischen verschiedenen Bakterienlinien.
Wir präsentieren Metalle für den Nachweis von konjugativen Plasmiden und die Effizienz der Formationskonjugation. Diese Technik ist einfach und sensibel. Es ist empfindlich, weil es Marker für das Plasmid, den Spender und den Empfänger verwendet.
Diese Marker sind selektierbar, was bedeutet, dass sie einzelne Ereignisse in sehr großen Populationen identifizieren können. Die von uns vorgestellten Protokolle sind nützlich, um die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen zu untersuchen und für die epidemiologische Überwachung, d.h. den Fluss arzneimittelresistenter Gene zu überwachen. Caison Warner, eine Doktorandin aus meinem Labor, und Pepper St. Clair, eine Studentin aus dem CAMS-Labor, demonstrieren das Verfahren.
Am ersten Tag streifen Sie die Spender und Empfänger separat aus den Glycerinvorräten auf das Medium C, das MacConkey-Agar ohne Antibiotika ist, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Beschriften Sie am zweiten Tag ein 14-Milliliter-Kulturröhrchen für jeden Spender und Empfänger. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von jedem Spender und Empfänger aus und züchten Sie sie in zwei Millilitern Mueller-Hinton-Bouillon bei 200 U / min für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius.
Messen Sie am dritten Tag die optische Dichte der 10-fachen salzhaltigen, über Nacht gewachsenen Kultur bei 600 Nanometern ohne Wirbelbildung. Verwenden Sie bei Bedarf sterilisierte Kochsalzlösung, um die optische Dichte auf zwei einzustellen. Beschriften Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen als Gegenröhrchen und geben Sie die Spender- und Empfängerstämme an.
Übertragen Sie 500 Mikroliter der eingestellten Suspension jedes Spenders und Empfängers in das Gegenröhrchen und mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Inversion. Zentrifugieren Sie das Gegenröhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 500 G. Pipettieren Sie 800 Mikroliter Überstand aus dem Gegenröhrchen, ohne das Pellet zu stören, und lassen Sie 200 Mikroliter im Röhrchen. Inkubieren Sie das Gegenröhrchen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Streifen Sie als Negativkontrolle die Nachtkultur der Spender auf Medium B und der Empfänger auf Medium A und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation am vierten Tag 800 Mikroliter Kochsalzlösung in das Gegenrohr geben und durch Vortexen resuspendieren. Nehmen Sie serielle Verdünnungen der passenden Suspension vor und geben Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf Medienplatten.
Sobald die Platten getrocknet sind, inkubieren Sie sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und berechnen Sie die Häufigkeit der Konjugation pro Spender oder Empfänger, wie im Manuskript beschrieben. Nachdem Sie DNA aus den bakteriellen Zellwänden mit einer einfachen Kochvorbereitungsextraktionsmethode extrahiert haben, markieren Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen als Pool in den erforderlichen PCR-Röhrchen mit dem Namen des Gens und der Probe. Geben Sie in das Röhrchen, das als Pool gekennzeichnet ist, steriles Wasser, PCR-Mastermix, Primer und Polymerase hinzu.
Vorsichtig mischen, indem Sie mindestens 10 Mal in einer gekühlten Umgebung auf und ab pipettieren. Geben Sie die Matrizen-DNA in das entsprechende Röhrchen und sichern Sie die PCR-Röhrchen mit Kappen. Setzen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler ein und starten Sie das Programm für Resistenzgene und Replikons, wie im Manuskript beschrieben.
Zur Bestätigung der Amplikon wird ein 1%iges Agarosegel durch Zugabe von Agarose und TAE-Puffer in einen 250-Milliliter-Kolben hergestellt und die Agarose in der Mikrowelle geschmolzen. Sobald die Agaroselösung auf etwa 55 Grad Celsius abgekühlt ist, unter einem Abzug sechs Mikroliter SYBR Green hinzufügen und mischen. Gießen Sie das Gel in eine mit Klebeband verschlossene Schale, um ein Verschütten zu vermeiden, und lassen Sie das Gel 15 bis 25 Minuten aushärten, bis eine Trübung auftritt.
Nachdem Sie das Klebeband entfernt haben, legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer und fügen Sie TAE-Puffer hinzu, um das Gel zu bedecken. Mischen Sie fünf Mikroliter des sechsfachen DNA-Gelbeladungsfarbstoffs mit 25 Mikrolitern jeder Reaktion, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. Laden Sie dann die Mischung in Vertiefungen, indem Sie Blasen vermeiden.
Nachdem Sie vier Mikroliter einer DNA-Leiter mit einem Kilobasenpaar in die erste Vertiefung gegeben haben, schließen Sie den Kammerdeckel und lassen Sie das Gel 60 Minuten lang bei 120 Volt und 400 Milliampere laufen. Visualisieren Sie das Gel unter UV-Licht und nehmen Sie das Bild auf. MacConkey-Agar unterschied die laktosepositiven Spender, die große rosa Kolonien produzierten, von den Empfängern und Transkonjutanten, die laktosenegativ waren und kleinere hellgelbe Kolonien produzierten.
Die fünf Konjugationseffizienzen eines Spenderstamms SSW4955 lagen alle in der gleichen Größenordnung, was darauf hindeutet, dass die Mobilisierung des konjugativen Plasmids unabhängig von der für die transkonjugante Identifizierung verwendeten Auswahl nachgewiesen werden kann. Während der Spenderstamm SSW7037 eine dreimal niedrigere Konjugationseffizienz zeigte, was den Vergleich der Konjugationseffizienz verschiedener Spender und Plasmidtypen mit denselben Empfängern ermöglicht. Die Gelelektrophorese von PCR-Produkten bestätigte das Vorhandensein von erwarteten Replikonen in Transkonjumanten.
Dieser Assay hängt vollständig von wählbaren Markern ab. Es müssen Kontrollen vorhanden sein, um zu bestätigen, dass jede Auswahl funktioniert, und Transkonjuganten müssen kolorimetrisch oder durch PCR bestätigt werden. Die hier vorgestellten Protokolle können für die Untersuchung von Konjugationsmodellen in vivo oder Biofilmmodellen sowie für die Untersuchung von Variablen, die die Konjugationseffizienz modulieren, angepasst werden.
Dieses Protokoll zum Nachweis mobilisierbarer Plasmide in großem Maßstab wird unser Verständnis des Genflusses in der Umwelt erheblich verbessern und die Variablen untersuchen, die die Effizienz der Konjugation beeinflussen.
