Bactérias como a E.coli carregam genes resistentes a antibióticos em plasmídeos conjugativos. Essa bactéria pode ser encontrada em hospitais, vivendo como comensais em animais e em ambientes aquáticos. Plasmídeos conjugativos naturais transferência horizontal de genes entre diferentes linhagens bacterianas.
Apresentamos metais para a detecção de plasmídeos conjugativos e eficiência de conjugação de formação. Esta técnica é simples e sensível. É sensível porque usa marcadores para o plasmídeo, o doador e o receptor.
Esses marcadores são selecionáveis, o que significa que eles podem identificar eventos únicos em populações muito grandes. Os protocolos que apresentamos são úteis para estudar a evolução da resistência aos antibióticos e para a vigilância epidemiológica, ou seja, para monitorar o fluxo de genes resistentes. Demonstrando o procedimento estarão Caison Warner, estudante de doutorado do meu laboratório, e Pepper St.Clair, estudante de graduação do laboratório CAMS.
No primeiro dia, liste separadamente os doadores e o receptor dos estoques de glicerol no meio C, que é o ágar MacConkey sem antibióticos e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No segundo dia, rotule um tubo de cultura de 14 mililitros para cada doador e receptor. Selecione uma única colônia de cada doador e receptor e cultivá-los em dois mililitros de caldo Mueller Hinton a 200 RPM por 18 horas a 37 graus Celsius.
No terceiro dia, meça a densidade óptica de 10 vezes a cultura de soro fisiológico diluída durante a noite a 600 nanômetros sem vórtice. Se necessário, use solução salina esterilizada para ajustar a densidade óptica para dois. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro como um tubo de acasalamento, indicando as cepas doadora e receptora.
Transfira 500 microlitros da suspensão ajustada de cada doador e receptor no tubo de acasalamento e misture suavemente a suspensão por inversão. Centrifugar o tubo de acasalamento à temperatura ambiente durante 10 minutos a 500 G.Pipeta para fora 800 microlitros de sobrenadante do tubo de acasalamento sem perturbar o pellet, deixando 200 microlitros no tubo. Incubar o tubo de acasalamento por 18 horas a 37 graus Celsius.
Além disso, como um controle negativo, estique a cultura noturna de doadores no meio B e receptores no meio A e incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, no quarto dia, adicionar 800 microlitros de solução salina ao tubo de acasalamento e ressuspender por vórtice. Efectuar diluições em série da suspensão de acasalamento e adicionar 100 microlitros de cada diluição em placas médias.
Uma vez que as placas estejam secas, incube-as por 18 horas a 37 graus Celsius e calcule a frequência de conjugação por doador ou por receptor, conforme descrito no manuscrito. Depois de extrair o DNA das paredes celulares bacterianas usando um método simples de extração de preparação de fervura, rotule um tubo de 1,5 mililitro como um pool nos tubos de PCR necessários com o nome do gene e da amostra. No tubo rotulado como pool, adicione água estéril, mistura mestra de PCR, primers e polimerase.
Misture suavemente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes em um ambiente refrigerado. Adicione o DNA modelo ao tubo correspondente e prenda os tubos de PCR com tampas. Coloque os tubos de PCR no termociclador e inicie o programa de genes de resistência e replicões conforme descrito no manuscrito.
Para confirmação do amplicon, prepare um gel de agarose a 1% adicionando agarose e tampão TAE em um frasco de 250 mililitros e derreta a agarose usando um micro-ondas. Uma vez que a solução de agarose tenha esfriado a aproximadamente 55 graus Celsius, sob um exaustor, adicione seis microlitros de SYBR Green e misture. Despeje o gel em uma bandeja selada com fita adesiva para evitar derramamento e deixe o gel se ajustar por 15 a 25 minutos até que a turbidez apareça.
Depois de remover a fita adesiva, coloque o gel na câmara de eletroforese e adicione o tampão TAE para cobrir o gel. Misture cinco microlitros de seis vezes o corante de carregamento de gel de DNA com 25 microlitros de cada reação pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Em seguida, carregue a mistura em poços, evitando bolhas.
Depois de adicionar quatro microlitros de uma escada de DNA de par de quilobases no primeiro poço, feche a tampa da câmara e passe o gel por 60 minutos a 120 volts e 400 miliamperes. Visualize o gel sob luz UV e grave a imagem. O ágar MacConkey distinguiu os doadores positivos para lactose que produziram grandes colônias rosa do receptor e transconjugantes, que eram lactose negativa e produziram colônias amarelas pálidas menores.
As cinco eficiências de conjugação de uma cepa doadora SSW4955 estavam todas dentro da mesma ordem de magnitude, indicando que a mobilização do plasmídeo conjugativo pode ser detectada independentemente da seleção usada para a identificação transconjugante. Já a cepa doadora SSW7037 apresentou eficiência de conjugação três vezes menor, o que permite a comparação das eficiências de conjugação de diferentes doadores e tipos de plasmídeos com os mesmos receptores. A eletroforese em gel de produtos de PCR confirmou a presença de replicões esperados em transconjugantes.
Este ensaio depende completamente de marcadores selecionáveis. Os controles devem estar em vigor para confirmar que cada seleção está funcionando e os transconjugantes precisam ser confirmados colorimetricamente ou por PCR. Os protocolos aqui apresentados podem ser adaptados para o estudo de modelos de conjugação in vivo ou biofilme, e para um estudo de variáveis moduladoras da eficiência da conjugação.
Este protocolo para detectar plasmídeos mobilizáveis em escala aumentará muito a nossa compreensão do fluxo de genes através do ambiente e estudará as variáveis que afetam a eficiência da conjugação.
