Las bacterias como E. coli portan genes resistentes a los antibióticos en plásmidos conjugativos. Esta bacteria se puede encontrar en hospitales, viviendo como comensales en animales y en ambientes acuáticos. Plásmidos conjugativos naturales de transferencia horizontal de genes entre diferentes linajes bacterianos.
Presentamos metales para la detección de plásmidos conjugativos y eficiencia de conjugación de formación. Esta técnica es simple y sensible. Es sensible porque utiliza marcadores para el plásmido, el donante y el receptor.
Estos marcadores son seleccionables, lo que significa que pueden identificar eventos individuales en poblaciones muy grandes. Los protocolos que presentamos son útiles para estudiar la evolución de la resistencia a los antibióticos y para la vigilancia epidemiológica, es decir, para monitorizar el flujo de genes farmacorresistentes. Demostrando el procedimiento estarán Caison Warner, un estudiante de doctorado de mi laboratorio, y Pepper St.Clair, un estudiante de pregrado del laboratorio CAMS.
El primer día, raye por separado a los donantes y al receptor de las existencias de glicerol en el medio C, que es agar MacConkey sin antibióticos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. En el segundo día, etiquete un tubo de cultivo de 14 mililitros para cada donante y receptor. Seleccione una sola colonia de cada donante y receptor y críelos en dos mililitros de caldo Mueller Hinton a 200 RPM durante 18 horas a 37 grados centígrados.
En el tercer día, mida la densidad óptica de 10 veces el cultivo diluido de solución salina durante la noche a 600 nanómetros sin vórtice. Si es necesario, use solución salina esterilizada para ajustar la densidad óptica a dos. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como tubo de acoplamiento, indicando las cepas donante y receptora.
Transfiera 500 microlitros de la suspensión ajustada de cada donante y receptor en el tubo de acoplamiento y mezcle suavemente la suspensión por inversión. Centrifugar el tubo de acoplamiento a temperatura ambiente durante 10 minutos a 500 G.Pipetear 800 microlitros de sobrenadante del tubo de acoplamiento sin alterar el pellet, dejando 200 microlitros en el tubo. Incubar el tubo de apareamiento durante 18 horas a 37 grados centígrados.
Además, como control negativo, raye la cultura nocturna de los donantes en los medios B y los receptores en los medios A e incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Después de la incubación, en el cuarto día, agregue 800 microlitros de solución salina al tubo de acoplamiento y resuspenda por vórtice. Haga diluciones seriadas de la suspensión de acoplamiento y agregue 100 microlitros de cada dilución en placas de medios.
Una vez que las placas estén secas, incubarlas durante 18 horas a 37 grados centígrados y calcular la frecuencia de conjugación por donante o por receptor como se describe en el manuscrito. Después de extraer el ADN de las paredes celulares bacterianas utilizando un método simple de extracción de preparación para hervir, etiquete un tubo de 1,5 mililitros como una piscina en los tubos de PCR requeridos con el nombre del gen y la muestra. En el tubo etiquetado como piscina, agregue agua estéril, mezcla maestra de PCR, cebadores y polimerasa.
Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces en un ambiente frío. Agregue el ADN de la plantilla al tubo correspondiente y asegure los tubos de PCR con tapas. Coloque los tubos de PCR en el termociclador e inicie el programa para genes de resistencia y replicones como se describe en el manuscrito.
Para la confirmación del amplicón, prepare un gel de agarosa al 1% agregando agarosa y tampón TAE en un matraz de 250 mililitros y derrita la agarosa con un microondas. Una vez que la solución de agarosa se haya enfriado a aproximadamente 55 grados centígrados, bajo una campana extractora, agregue seis microlitros de SYBR Green y mezcle. Vierta el gel en una bandeja sellada con cinta adhesiva para evitar derrames y deje que el gel se asiente durante 15 a 25 minutos hasta que aparezca la turbidez.
Después de retirar la cinta adhesiva, coloque el gel en la cámara de electroforesis y agregue un tampón TAE para cubrir el gel. Mezcle cinco microlitros de seis veces el tinte de carga de gel de ADN con 25 microlitros de cada reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Luego cargue la mezcla en pozos evitando burbujas.
Después de agregar cuatro microlitros de una escalera de ADN de un par de kilobases en el primer pozo, cierre la tapa de la cámara y ejecute el gel durante 60 minutos a 120 voltios y 400 miliamperios. Visualice el gel bajo luz UV y grabe la imagen. El agar MacConkey distinguió los donantes positivos de lactosa que produjeron grandes colonias rosadas del receptor y los transconjugantes, que eran lactosa negativos y produjeron colonias más pequeñas de color amarillo pálido.
Las cinco eficiencias de conjugación de una cepa donante SSW4955 estaban todas dentro del mismo orden de magnitud, lo que indica que la movilización del plásmido conjugativo se puede detectar independientemente de la selección utilizada para la identificación transconjugante. Mientras que la cepa donante SSW7037 mostró una eficiencia de conjugación tres veces menor, lo que permite la comparación de eficiencias de conjugación de diferentes donantes y tipos de plásmidos con los mismos receptores. La electroforesis en gel de los productos de PCR confirmó la presencia de replicones esperados en transconjugantes.
Este ensayo depende completamente de marcadores seleccionables. Los controles deben estar en su lugar para confirmar que cada selección está funcionando y los transconjugantes deben confirmarse colorimétricamente o por PCR. Los protocolos aquí presentados pueden ser adaptados para el estudio de modelos de conjugación in vivo o biofilm, y para un estudio de variables moduladoras de eficiencia de conjugación.
Este protocolo para detectar plásmidos movilizables a escala contribuirá en gran medida a nuestra comprensión del flujo de genes a través del medio ambiente y para estudiar las variables que afectan la eficiencia de la conjugación.
