חיידקים כמו E.coli נושאים גנים עמידים לאנטיביוטיקה בפלסמידים מצומדים. חיידק זה יכול להימצא בבתי חולים, לחיות כקומנסלים בבעלי חיים, ובסביבות ימיות. פלסמידים מצומדים טבעיים העברה אופקית של גנים בין שושלות חיידקים שונות.
אנו מציגים מתכות לאיתור פלסמידים מצומדים ויעילות הצמדה של היווצרות. טכניקה זו פשוטה ורגישה. הוא רגיש מכיוון שהוא משתמש בסמנים עבור הפלסמיד, התורם והמקבל.
סמנים אלה ניתנים לבחירה, כלומר הם יכולים לזהות אירועים בודדים באוכלוסיות גדולות מאוד. הפרוטוקולים שאנו מציגים שימושיים לחקר האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה ולמעקב אפידמיולוגי, כלומר לניטור זרימת גנים עמידים לתרופות. הדגמת ההליך תהיה קייסון וורנר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, ופפר סנט קלייר, סטודנטית לתואר ראשון ממעבדת CAMS.
ביום הראשון, יש לפזר בנפרד את התורמים והמקבלים ממלאי הגליצרול במדיה C שהיא אגר מקונקי ללא אנטיביוטיקה ולדגור לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום השני, תייגו צינור תרבית של 14 מיליליטר לכל תורם ומקבל. בחר מושבה אחת של כל תורם ומקבל וגדל אותם בשני מיליליטר של מרק מולר הינטון ב 200 סל"ד במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
ביום השלישי, מדדו את הצפיפות האופטית של פי 10 מתרבית לילה מדוללת במי מלח ב-600 ננומטר ללא מערבולות. במידת הצורך, השתמש בתמיסת מלח מעוקרת כדי להתאים את הצפיפות האופטית לשתיים. תייגו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כצינור הזדווגות, המציין את הזנים של התורם והמקבל.
מעבירים 500 מיקרוליטר של התרחיף המותאם של כל תורם ומקבל בצינור ההזדווגות ומערבבים בעדינות את התרחיף בהיפוך. צנטריפוגה את צינור ההזדווגות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 500 G.Pipette להוציא 800 מיקרוליטר של supernatant מתוך צינור ההזדווגות מבלי להפריע את הכדורית, משאיר 200 מיקרוליטר בצינור. לדגור על צינור ההזדווגות במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
יתר על כן, כבקרה שלילית, הפסיקו את תרבות הלילה של תורמים במדיה B ומקבלי מדיה A ודגרו על הצלחות בן לילה ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, ביום הרביעי, להוסיף 800 מיקרוליטר של תמיסת מלח לצינור ההזדווגות ולהשהות מחדש על ידי מערבולת. בצע דילולים סדרתיים של מתלה ההזדווגות והוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות מדיה.
לאחר ייבוש הלוחות, דגרו עליהן במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחשבו את תדירות הצמידות לכל תורם או לכל מקבל כמתואר בכתב היד. לאחר חילוץ DNA מדפנות תאי החיידק בשיטת מיצוי פשוטה להכנת רתיחה, יש לתייג צינור של 1.5 מיליליטר כמאגר בצינורות ה-PCR הנדרשים עם שם הגן והדגימה. בצינור המסומן כבריכה, הוסיפו מים סטריליים, תערובת מאסטר PCR, פריימרים ופולימראז.
מערבבים בעדינות על ידי פיטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים בסביבה צוננת. הוסף את ה- DNA של התבנית לצינור המתאים וחבר את צינורות ה- PCR באמצעות מכסים. הכניסו את צינורות ה-PCR לתרמוסייקלר והתחילו את התוכנית לגני התנגדות ורפליקונים כמתואר בכתב היד.
לאישור אמפליקון, הכינו ג'ל אגרוז 1% על ידי הוספת אגרוז וחיץ TAE בבקבוק של 250 מיליליטר והמיסו את האגרוז באמצעות מיקרוגל. לאחר שתמיסת האגרוז התקררה לכ-55 מעלות צלזיוס, מתחת למכסה אדים, הוסיפו שישה מיקרוליטרים של SYBR Green וערבבו. יוצקים את הג'ל למגש אטום בסרט הדבקה כדי למנוע שפיכה ולאפשר לג'ל להתייצב למשך 15 עד 25 דקות עד להופעת עכירות.
לאחר הסרת סרט ההדבקה, הכניסו את הג'ל לתא האלקטרופורזה והוסיפו חיץ TAE לכיסוי הג'ל. ערבבו חמישה מיקרוליטרים של שש פעמים צבע טעינת ג'ל DNA עם 25 מיקרוליטר מכל תגובה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. לאחר מכן לטעון את התערובת לתוך בארות על ידי הימנעות בועות.
לאחר הוספת ארבעה מיקרוליטרים של סולם DNA זוגי קילו לתוך הבאר הראשונה, לסגור את מכסה התא ולהפעיל את הג'ל במשך 60 דקות ב 120 וולט ו 400 מיליאמפר. דמיינו את הג'ל תחת אור UV והקליטו את התמונה. אגר מקונקי הבחין בין התורמים החיוביים ללקטוז שיצרו מושבות ורודות גדולות מהמקבל לבין טרנסקוניוגנטים, שהיו שליליים ללקטוז ויצרו מושבות קטנות יותר בצבע צהוב בהיר.
חמש יעילות הצמידות של זן תורם SSW4955 היו כולן באותו סדר גודל, מה שמצביע על כך שניתן לזהות את הניוד של פלסמיד מצומד ללא קשר לבחירה המשמשת לזיהוי טרנס-מצומד. בעוד שהזן התורם SSW7037 הראה יעילות צימוד נמוכה פי שלושה, מה שמאפשר השוואה של יעילות הצמידות של תורמים שונים וסוגי פלסמיד עם אותם מושתלים. אלקטרופורזה ג'ל של מוצרי PCR אישר את נוכחותם של replicons צפוי transconjugants.
בדיקה זו תלויה לחלוטין בסמנים הניתנים לבחירה. בקרות חייבות להיות במקום כדי לאשר שכל בחירה פועלת ויש לאשר טרנס-צימודים באופן צבעוני או באמצעות PCR. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתנים להתאמה לחקר מודלים של הצמדה in vivo או ביופילם, ולמשתנים חוקרים המווסתים את יעילות הצמידה.
פרוטוקול זה לגילוי פלסמידים ניתנים לניידות בקנה מידה גדול יוסיף רבות להבנתנו את זרימת הגנים בסביבה, ולחקר המשתנים המשפיעים על יעילות הצמידה.
