大腸菌のような細菌は、接合プラスミドに抗生物質耐性遺伝子を持っています。この細菌は、病院、動物の共生生物、および水生環境で見つけることができます。天然接合プラスミドは、異なる細菌系統間の遺伝子の水平移動。
接合プラスミドの検出と形成結合効率のための金属を紹介します。この手法は単純で敏感です。プラスミド、ドナー、レシピエントのマーカーを使用するため、感度があります。
これらのマーカーは選択可能であり、非常に大きな集団における単一の事象を識別できることを意味する。私たちが提示するプロトコルは、抗生物質耐性の進化を研究し、疫学的サーベイランス、つまり薬剤耐性遺伝子の流れを監視するのに役立ちます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるケイソンワーナーと、CAMSラボの学部生であるペッパーセントクレアです。
初日に、抗生物質を含まないマッコンキー寒天培地である培地Cのグリセロールストックからドナーとレシピエントを別々にストリークし、摂氏37度で一晩インキュベートします。2日目に、ドナーとレシピエントごとに14ミリリットルの培養チューブにラベルを付けます。各ドナーとレシピエントの単一のコロニーを選択し、摂氏37度で18時間、200 RPMで2ミリリットルのミューラーヒントンブロスで栽培します。
3日目に、10倍生理食塩水希釈し、ボルテックスせずに600ナノメートルで一晩増殖培養し培養液の光学濃度を測定する。必要に応じて、滅菌生理食塩水を使用して光学濃度を2に調整します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブを相手チューブとしてラベル付けし、ドナーとレシピエントの株を示します。
各ドナーとレシピエントの調整済み懸濁液500マイクロリットルを嵌合チューブに移し、転倒によって懸濁液を穏やかに混合します。ペレットを乱すことなく、500 G.Pipetteで10分間、室温で10分間、合わせチューブから800マイクロリットルの上清を取り出し、チューブ内に200マイクロリットルを残します。嵌合チューブを摂氏37度で18時間インキュベートします。
さらに、ネガティブコントロールとして、培地B上のドナーと培地A上のレシピエントの一晩培養物をストリークし、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、4日目に、800マイクロリットルの生理食塩水を嵌合チューブに加え、ボルテックスによって再懸濁します。嵌合懸濁液の連続希釈を行い、各希釈液をメディアプレートに100マイクロリットル加えます。
プレートが乾燥したら、摂氏37度で18時間インキュベートし、原稿に記載されているように、ドナーごとまたはレシピエントあたりの抱合の頻度を計算します。簡単なボイル調製抽出法を使用して細菌の細胞壁からDNAを抽出した後、必要なPCRチューブのプールとして1.5ミリリットルのチューブに遺伝子とサンプルの名前をラベル付けします。プールとラベル付けされたチューブに、滅菌水、PCRマスターミックス、プライマー、およびポリメラーゼを追加します。
冷やした環境で少なくとも10回上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。テンプレートDNAを対応するチューブに追加し、PCRチューブをキャップで固定します。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、原稿に記載されているように耐性遺伝子とレプリコンのプログラムを開始します。
アンプリコンの確認のために、250ミリリットルのフラスコにアガロースとTAEバッファーを加えて1%アガロースゲルを調製し、マイクロ波を使用してアガロースを溶かします。アガロース溶液が摂氏約55度に冷えたら、ドラフトの下で6マイクロリットルのSYBR Greenを加えて混合します。こぼれないように粘着テープで密封されたトレイにゲルを注ぎ、濁りが現れるまでゲルを15〜25分間セットします。
粘着テープをはがした後、ゲルを電気泳動チャンバーに入れ、TAEバッファーを加えてゲルを覆います。少なくとも10回上下にピペッティングすることにより、5マイクロリットルの6倍のDNAゲルローディング色素を25マイクロリットルの各反応と混合します。次に、気泡を避けて混合物をウェルに入れます。
最初のウェルに4マイクロリットルの1キロ塩基対DNAラダーを加えた後、チャンバーの蓋を閉め、120ボルトおよび400ミリアンペアで60分間ゲルを実行します。UV光の下でゲルを視覚化し、画像を記録します。MacConkey寒天培地は、大きなピンク色のコロニーを生成する乳糖陽性ドナーと、乳糖陰性で小さな淡黄色コロニーを生成するトランスコンジュガントを区別しました。
ドナー株SSW4955の5つの接合効率はすべて同じ桁内であり、トランスコンジュガント同定に使用される選択に関係なく、接合プラスミドの動員を検出できることを示しています。一方、ドナー株SSW7037は3倍低い抱合効率を示し、異なるドナーおよび同じレシピエントを持つプラスミドタイプの接合効率の比較を可能にします。PCR産物のゲル電気泳動により、トランスコンジュガントに期待されるレプリコンの存在が確認されました。
このアッセイは、選択可能なマーカーに完全に依存します。各選択が機能していることを確認するためにコントロールが整っている必要があり、トランスコンジュガントは比色法またはPCRによって確認する必要があります。ここに提示されたプロトコルは、in vivoまたはバイオフィルムモデルのコンジュゲーションの研究、およびコンジュゲーション効率を調節する変数の研究に適合させることができます。
動員可能なプラスミドを大規模に検出するためのこのプロトコルは、環境全体の遺伝子の流れの理解に大きく役立ち、接合の効率に影響を与える変数を研究するのに役立ちます。
