Les bactéries comme E. coli portent des gènes résistants aux antibiotiques dans les plasmides conjugatifs. Cette bactérie peut être trouvée dans les hôpitaux, vivant comme commensaux chez les animaux, et dans les milieux aquatiques. Plasmides conjugatifs naturels transfert horizontal de gènes entre différentes lignées bactériennes.
Nous présentons des métaux pour la détection des plasmides conjugatifs et l’efficacité de la conjugaison de formation. Cette technique est simple et sensible. Il est sensible parce qu’il utilise des marqueurs pour le plasmide, le donneur et le receveur.
Ces marqueurs sont sélectionnables, ce qui signifie qu’ils peuvent identifier des événements uniques dans de très grandes populations. Les protocoles que nous présentons sont utiles pour étudier l’évolution de la résistance aux antibiotiques et pour la surveillance épidémiologique, c’est-à-dire pour surveiller le flux de gènes résistants aux médicaments. Caison Warner, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, et Pepper St.Clair, un étudiant de premier cycle du laboratoire CAMS, feront la démonstration de la procédure.
Le premier jour, striez séparément les donneurs et les receveurs des stocks de glycérol sur le milieu C qui est une gélose MacConkey sans antibiotiques et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le deuxième jour, étiquetez un tube de culture de 14 millilitres pour chaque donneur et receveur. Sélectionnez une seule colonie de chaque donneur et receveur et cultivez-les dans deux millilitres de bouillon Mueller Hinton à 200 RPM pendant 18 heures à 37 degrés Celsius.
Le troisième jour, mesurez la densité optique de 10 fois la culture saline diluée pendant la nuit à 600 nanomètres sans vortex. Si nécessaire, utilisez une solution saline stérilisée pour ajuster la densité optique à deux. Étiquetez un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre comme tube d’accouplement, en indiquant les souches donneuse et receveuse.
Transférer 500 microlitres de la suspension ajustée de chaque donneur et receveur dans le tube d’accouplement et mélanger délicatement la suspension par inversion. Centrifuger le tube d’accouplement à température ambiante pendant 10 minutes à 500 G.Pipette 800 microlitres de surnageant du tube d’accouplement sans déranger la pastille, en laissant 200 microlitres dans le tube. Incuber le tube d’accouplement pendant 18 heures à 37 degrés Celsius.
De plus, comme contrôle négatif, striez la culture nocturne des donneurs sur le milieu B et des receveurs sur le milieu A et incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, le quatrième jour, ajoutez 800 microlitres de solution saline dans le tube d’accouplement et remettez en suspension par vortex. Faire des dilutions en série de la suspension d’accouplement et ajouter 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques de support.
Une fois les plaques séchées, incuber pendant 18 heures à 37 degrés Celsius et calculer la fréquence de conjugaison par donneur ou par receveur comme décrit dans le manuscrit. Après avoir extrait l’ADN des parois cellulaires bactériennes à l’aide d’une méthode simple d’extraction de préparation à l’ébullition, étiquetez un tube de 1,5 millilitre comme un pool dans les tubes PCR requis avec le nom du gène et de l’échantillon. Dans le tube étiqueté comme piscine, ajoutez de l’eau stérile, du mélange maître PCR, des apprêts et de la polymérase.
Mélanger doucement en pipetant de haut en bas au moins 10 fois dans un environnement réfrigéré. Ajoutez l’ADN modèle au tube correspondant et fixez les tubes PCR avec des bouchons. Placez les tubes de PCR dans le thermocycleur et démarrez le programme pour les gènes de résistance et les réplicons comme décrit dans le manuscrit.
Pour la confirmation de l’amplicon, préparez un gel d’agarose à 1% en ajoutant de l’agarose et du tampon TAE dans une fiole de 250 millilitres et faites fondre l’agarose au micro-ondes. Une fois que la solution d’agarose a refroidi à environ 55 degrés Celsius, sous une hotte, ajoutez six microlitres de SYBR Green et mélangez. Versez le gel dans un plateau scellé avec du ruban adhésif pour éviter les déversements et laissez le gel prendre pendant 15 à 25 minutes jusqu’à ce que la turbidité apparaisse.
Après avoir retiré le ruban adhésif, placez le gel dans la chambre d’électrophorèse et ajoutez un tampon TAE pour couvrir le gel. Mélanger cinq microlitres de six fois le colorant de chargement de gel d’ADN avec 25 microlitres de chaque réaction en pipetant de haut en bas au moins 10 fois. Ensuite, chargez le mélange dans des puits en évitant les bulles.
Après avoir ajouté quatre microlitres d’échelle d’ADN d’une paire kilobase dans le premier puits, fermez le couvercle de la chambre et faites fonctionner le gel pendant 60 minutes à 120 volts et 400 milliampères. Visualisez le gel sous lumière UV et enregistrez l’image. La gélose MacConkey a distingué les donneurs positifs au lactose qui produisaient de grandes colonies roses du receveur et des transconjuguants, qui étaient négatifs au lactose et produisaient de plus petites colonies jaune pâle.
Les cinq efficacités de conjugaison d’une souche donneuse SSW4955 étaient toutes du même ordre de grandeur, ce qui indique que la mobilisation du plasmide conjugatif peut être détectée quelle que soit la sélection utilisée pour l’identification des transconjuguants. Alors que la souche de donneur SSW7037 a montré une efficacité de conjugaison trois fois inférieure, ce qui permet de comparer les efficacités de conjugaison de différents donneurs et types plasmidiques avec les mêmes receveurs. L’électrophorèse sur gel des produits PCR a confirmé la présence de réplicons attendus chez les transconjuguants.
Ce test dépend entièrement de marqueurs sélectionnables. Des contrôles doivent être en place pour confirmer que chaque sélection fonctionne et les transconjuguants doivent être confirmés colorimétriquement ou par PCR. Les protocoles présentés ici peuvent être adaptés pour l’étude de modèles de conjugaison in vivo ou de biofilm, et pour une étude de variables modulant l’efficacité de la conjugaison.
Ce protocole de détection des plasmides mobilisables à grande échelle contribuera grandement à notre compréhension du flux de gènes dans l’environnement et à l’étude des variables affectant l’efficacité de la conjugaison.
