在棕榈酸诱导的 体外 模型中研究鸭嘴豆素D对非酒精性脂肪肝疾病的保护作用

该方法演示了AML-12细胞的使用，这将允许模型构建和研究扁平蛋白D对NAFLD的保护作用。过度依赖动物模型的使用增加了治疗药物开发的负担。在NAFLD药物开发的早期阶段使用细胞模型更实用且更具成本效益。

该中药模型可能有助于提高对桔霉素D生物学功能的理解，并有助于研究其他中药治疗NAFLD的应用。首先在12孔板中每孔接种一毫升AML-12细胞。然后将12孔板分成四个不同的治疗组，并将它们标记为对照，PD处理，PA处理和PA加PD处理组。

每孔向对照和PD处理组加入一毫升正常细胞培养基。向PA处理组和PA加PD处理组加入1毫升补充有300微摩尔棕榈酸的正常细胞培养基。孵育24小时后，除去细胞的培养基，然后用一毫升无血清培养基洗涤细胞两次。

接下来，向对照组加入一毫升补充有载体的正常细胞培养基，向PD处理组加入一毫升补充有一微摩尔鸭嘴豆素D的正常细胞培养基。向PA处理组加入1毫升补充有300微摩尔棕榈酸的正常细胞培养基，向PA加PD处理组加入1毫升补充有300微摩尔棕榈酸和1微摩尔扁平抑素D的正常细胞培养基。处理细胞24小时后，每孔用一毫升1X PBS洗涤细胞三次。

然后用每孔100微升10微摩尔DCFH-DA对细胞进行染色。将细胞在黑暗中孵育30分钟。孵育后，用1X PBS洗涤细胞三次，并向每个孔中加入一毫升1X PBS。

将12孔板放在显微镜载物台上，并使用20X物镜在200X放大倍率下观察细胞的形态。为了测量线粒体膜电位，用每孔一毫升1X PBS洗涤先前制备的处理细胞三次。然后用100微升每毫升5微克JC-1工作溶液对细胞进行染色，并在黑暗中将细胞在37摄氏度下孵育30分钟。

然后用1X PBS洗涤细胞三次，并向每个孔中加入一毫升1X PBS。将12孔板放在显微镜载物台上，并使用20X物镜在200X放大倍率下观察细胞的形态。裂解处理过的细胞并将细胞裂解物收集到1.5毫升微量离心管中。

将试管以 12， 000 G 在 4 摄氏度下离心 20 分钟。然后以1-4的体积比向细胞裂解物上清液中加入5X SDS-PAGE样品上样缓冲液。接下来，将制备的12%SDS-PAGE凝胶与12孔放入电泳槽中，并加入用超纯水稀释至推荐高度限制的1X SDS样品缓冲液。

SDS-PAGE电泳后，将蛋白质电转移到0.45微米PVDF膜上。将膜在5毫升在封闭缓冲液中稀释的一抗中孵育。使用针对 LC-III、p62 和 β-肌动蛋白的特异性抗体。

在四摄氏度下孵育过夜。然后将PVDF膜与兔抗小鼠LGG HRP二抗在封闭缓冲液中稀释1至10， 000。将膜在室温避光下孵育两个小时。

孵育后，将PVDF膜放在保鲜膜上。加入适量的ECL工作溶液，孵育两分钟。然后取出ECL工作溶液，将PVDF膜暴露在成像系统中以进行图像显影。

DCFH-DA染色表明，桔霉素D可显著降低ALM-12细胞的细胞内ROS水平，表明该处理可降低细胞氧化应激。此外，棕榈酸处理细胞中代表JC-1单体或去极化线粒体的绿色荧光高于未处理细胞，而棕榈酸处理细胞中代表JC-1二聚体或极化线粒体的红色荧光低于未处理细胞，表明棕榈酸诱导的MMP去极化。此外，与模型组相比，桔梗素D处理组JC-1单体与二聚体的比例有所下降，表明其可以改善棕榈酸诱导的MMP。

通过蛋白质印迹法研究自噬相关蛋白LC-III和p62的蛋白表达水平。棕榈酸处理后LC-32与LC-31的比例显著降低，p62的蛋白表达水平升高。另一方面，桔霉素D显著降低了p62的蛋白表达水平，增加了LC-32与LC-31的比例，表明棕榈酸诱导的自噬通量恢复。

如果阴性对照组中细胞的荧光值相对较高，则可以根据需要调整荧光探针的工作浓度。