توضح هذه الطريقة استخدام خلايا AML-12 التي ستسمح ببناء النموذج والتحقيق في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على NAFLD. يزيد الاعتماد المفرط على استخدام النماذج الحيوانية في عبء تطوير الأدوية العلاجية. يعد استخدام نماذج الخلايا في المرحلة المبكرة من تطوير أدوية NAFLD أكثر عملية وفعالية من حيث التكلفة.
قد يساعد نموذج الطب الصيني التقليدي هذا في تحسين فهم الوظيفة البيولوجية للبلاتيكودين D ويساعد في دراسة استخدام الطب الصيني التقليدي الآخر لعلاج NAFLD. ابدأ ببذر ملليلتر واحد من خلايا AML-12 لكل بئر في 12 لوحة بئر. ثم قسم الصفيحة المكونة من 12 بئرا إلى أربع مجموعات معالجة مختلفة وقم بتسميتها على أنها مجموعة تحكم ، ومعالجة PD ، ومعالجة PA ، ومجموعة معالجة PA بالإضافة إلى PD.
أضف ملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا الطبيعية لكل بئر إلى المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة بمرض باركنسون. أضف ملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا الطبيعية المكملة ب 300 ميكرومولار حمض بالمتيك إلى المجموعة المعالجة ب PA و PA plus PD المعالجة. بعد 24 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ثم اغسل الخلايا بمليلتر واحد من الوسائط الخالية من المصل مرتين.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا العادية المكملة بمركبة إلى المجموعة الضابطة وملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا العادية المكملة ب platycodin D ميكرومولار واحد إلى المجموعة المعالجة PD. أضف ملليلترا واحدا من وسائط زراعة الخلايا العادية المكملة ب 300 ميكرومولار حمض البالمتيك إلى المجموعة المعالجة ب PA وملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا العادية المكملة ب 300 ميكرومولار حمض البالمتيك و platycodin D ميكرومولار واحد إلى المجموعة المعالجة PA plus PD. بعد معالجة الخلايا لمدة 24 ساعة ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من 1X PBS لكل بئر ثلاث مرات.
ثم تلطيخ الخلايا مع 100 ميكرولتر من 10 ميكرومولار DCFH-DA لكل بئر. احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام 1X PBS ثلاث مرات وأضف ملليلتر واحد من 1X PBS إلى كل بئر.
ضع لوحة 12 بئرا على مرحلة المجهر واستخدم هدف 20X لمراقبة مورفولوجيا الخلايا عند تكبير 200X. لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، اغسل الخلايا المعالجة المحضرة مسبقا بمليلتر واحد من 1X PBS لكل بئر ثلاث مرات. ثم تلطيخ الخلايا مع 100 ميكرولتر من خمسة ميكروغرام لكل مليلتر JC-1 حل العمل واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
ثم اغسل الخلايا باستخدام 1X PBS ثلاث مرات وأضف ملليلتر واحد من 1X PBS إلى كل بئر. ضع لوحة 12 بئرا على مرحلة المجهر واستخدم هدف 20X لمراقبة مورفولوجيا الخلايا عند تكبير 200X. تحلل الخلايا المعالجة وتجمع الخلية المحللة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 12،000 غرام لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم أضف 5X SDS-PAGE عينة تحميل المخزن المؤقت إلى الخلية محللة طاف بنسبة حجم من واحد إلى أربعة. بعد ذلك ، ضع جل 12٪ SDS-PAGE المحضر مع 12 بئرا في خزان الرحلان الكهربائي وأضف 1X SDS حتى المخزن المؤقت للعينة المخفف بالماء عالي النقاء إلى حد الارتفاع الموصى به.
بعد الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، قم بإجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى غشاء PVDF 0.45 ميكرون. احتضان الغشاء في خمسة ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في منع العازلة. استخدم الأجسام المضادة الخاصة ب LC-III و p62 و beta-actin.
احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. ثم احتضان غشاء PVDF مع الجسم المضاد الثانوي للأرانب LGG HRP المخفف من واحد إلى 10،000 في منع العازلة. احتضان الغشاء في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء لمدة ساعتين.
بعد الحضانة ، ضع غشاء PVDF على غلاف بلاستيكي. أضف كمية مناسبة من محلول عمل ECL واحتضانه لمدة دقيقتين. ثم قم بإزالة حل عمل ECL وكشف غشاء PVDF في نظام التصوير لتطوير الصورة.
أظهر تلطيخ DCFH-DA أن platycodin D يمكن أن يقلل بشكل كبير من مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في خلايا ALM-12 ، مما يشير إلى أن هذا العلاج يمكن أن يقلل من الإجهاد التأكسدي الخلوي. علاوة على ذلك ، كان التألق الأخضر الذي يمثل مونومرات JC-1 أو الميتوكوندريا غير المستقطبة أعلى في الخلايا المعالجة بحمض البالمتيك منه في الخلايا غير المعالجة ، في حين أن التألق الأحمر الذي يمثل ثنائيات JC-1 أو الميتوكوندريا المستقطبة كان أقل في الخلايا المعالجة بحمض البالمتيك من الخلايا غير المعالجة ، مما يشير إلى إزالة استقطاب MMP الناجم عن حمض البالمتيك. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة النموذج ، انخفضت نسبة مونومرات JC-1 إلى الدايمرات في مجموعة معالجة platycodin D ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يحسن MMP الناجم عن حمض النخيل.
تم فحص مستويات التعبير البروتيني للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي LC-III و p62 بواسطة النشاف الغربي. انخفضت نسبة LC-32 إلى LC-31 بشكل ملحوظ وزاد مستوى تعبير البروتين p62 بعد معالجته بحمض النخيل. من ناحية أخرى ، قلل platycodin D بشكل كبير من مستوى تعبير البروتين من p62 وزاد من نسبة LC-32 إلى LC-31 ، مما يشير إلى استعادة تدفق الالتهام الذاتي الناجم عن حمض النخيل.
إذا كانت القيمة الفلورية للخلايا في مجموعة التحكم السلبية عالية نسبيا ، فيمكن تعديل تركيزات العمل لمجسات الفلورسنت حسب الحاجة.
