Questo metodo dimostra l'uso di cellule AML-12 che consentiranno la costruzione del modello e lo studio degli effetti protettivi della platycodin D sulla NAFLD. L'eccessiva dipendenza dall'uso di modelli animali aumenta l'onere dello sviluppo di farmaci terapeutici. L'utilizzo di modelli cellulari nella fase iniziale dello sviluppo di farmaci NAFLD è più pratico ed economico.
Questo modello TCM può aiutare a migliorare la comprensione della funzione biologica della platycodin D e aiutare a studiare l'uso di altri TCM per il trattamento della NAFLD. Inizia seminando un millilitro di cellule AML-12 per pozzetto in piastre da 12 pozzetti. Quindi dividere la piastra a 12 pozzetti in quattro diversi gruppi di trattamento ed etichettarli come gruppo trattato con controllo, trattato PD, trattato PA e gruppo trattato PA più PD.
Aggiungere un millilitro del normale terreno di coltura cellulare per pozzetto al gruppo di controllo e al gruppo trattato con PD. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 al gruppo trattato con PA e PA più PD. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere il terreno di coltura delle cellule e quindi lavare le cellule con un millilitro di terreno senza siero due volte.
Successivamente, aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con un veicolo al gruppo di controllo e un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con un platycodin D micromolare al gruppo trattato con PD. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 al gruppo trattato con PA e un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 e un platycodin D micromolare al gruppo trattato PA più PD. Dopo aver trattato le cellule per 24 ore, lavare le cellule con un millilitro di 1X PBS per pozzetto tre volte.
Quindi colorare le cellule con 100 microlitri di 10 micromolari DCFH-DA per pozzetto. Incubare le cellule al buio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 1X PBS tre volte e aggiungere un millilitro di 1X PBS a ciascun pozzetto.
Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio e utilizzare un obiettivo 20X per osservare la morfologia delle cellule con un ingrandimento di 200X. Per misurare il potenziale della membrana mitocondriale, lavare le cellule trattate preparate in precedenza con un millilitro di 1X PBS per pozzetto tre volte. Quindi colorare le cellule con 100 microlitri di cinque microgrammi per millilitro di soluzione di lavoro JC-1 e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio.
Quindi lavare le celle con 1X PBS tre volte e aggiungere un millilitro di 1X PBS a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio e utilizzare un obiettivo 20X per osservare la morfologia delle cellule con un ingrandimento di 200X. Lisare le cellule trattate e raccogliere il lisato cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare i tubi a 12.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere 5X SDS-PAGE sample loading buffer al surnatante di lisato cellulare con un rapporto di volume da uno a quattro. Quindi, posizionare il gel 12% SDS-PAGE preparato con 12 pozzetti nel serbatoio di elettroforesi e aggiungere 1X SDS fino tampone campione diluito con acqua ultrapura al limite di altezza raccomandato.
Dopo l'elettroforesi SDS-PAGE, effettuare l'elettrotrasferimento delle proteine su una membrana PVDF da 0,45 micron. Incubare la membrana in cinque millilitri degli anticorpi primari diluiti nel tampone bloccante. Utilizzare anticorpi specifici per LC-III, p62 e beta-actina.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi incubare la membrana PVDF con anticorpo secondario LGG HRP anti-topo coniglio diluito da uno a 10.000 in tampone bloccante. Incubare la membrana a temperatura ambiente al riparo dalla luce per due ore.
Dopo l'incubazione, posizionare la membrana PVDF su un involucro di plastica. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di lavoro ECL e incubare per due minuti. Quindi rimuovere la soluzione di lavoro ECL ed esporre la membrana PVDF nel sistema di imaging per lo sviluppo dell'immagine.
La colorazione DCFH-DA ha mostrato che la platycodin D potrebbe ridurre significativamente il livello di ROS intracellulare nelle cellule ALM-12, indicando che questo trattamento può ridurre lo stress ossidativo cellulare. Inoltre, la fluorescenza verde che rappresenta i monomeri JC-1 o i mitocondri depolarizzati era più alta nelle cellule trattate con acido palmitico rispetto alle cellule non trattate, mentre la fluorescenza rossa che rappresentava i dimeri JC-1 o i mitocondri polarizzati era inferiore nelle cellule trattate con acido palmitico rispetto alle cellule non trattate, indicando la depolarizzazione MMP indotta dall'acido palmitico. Inoltre, rispetto al gruppo modello, il rapporto tra monomeri JC-1 e dimeri è diminuito nel gruppo di trattamento con platycodin D, indicando che potrebbe migliorare l'MMP indotto dall'acido palmitico.
I livelli di espressione proteica delle proteine LC-III e p62 correlate all'autofagia sono stati studiati mediante western blotting. Il rapporto tra LC-32 e LC-31 è diminuito significativamente e il livello di espressione proteica di p62 è aumentato dopo essere stato trattato con acido palmitico. D'altra parte, la platycodin D ha ridotto significativamente il livello di espressione proteica di p62 e aumentato il rapporto tra LC-32 e LC-31, indicando il ripristino del flusso autofagico indotto dall'acido palmitico.
Se il valore di fluorescenza delle cellule nel gruppo di controllo negativo è relativamente alto, le concentrazioni di lavoro delle sonde fluorescenti possono essere regolate secondo necessità.
