Este método demonstra o uso de células AML-12 que permitirão a construção de modelos e a investigação dos efeitos protetores da platicodina D sobre a DHGNA. A dependência excessiva do uso de modelos animais aumenta a carga do desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. O uso de modelos celulares no estágio inicial do desenvolvimento de fármacos para DHGNA é mais prático e custo-efetivo.
Este modelo de MTC pode ajudar a melhorar a compreensão da função biológica da platicodina D e ajudar a estudar o uso de outros MTC para o tratamento da DHGNA. Comece semeando um mililitro de células AML-12 por poço em placas de 12 poços. Em seguida, divida a placa de 12 poços em quatro grupos de tratamento diferentes e rotule-os como grupo controle, tratado com DP, tratado com PA e tratado com PA mais DP.
Adicionar um mililitro do meio de cultura celular normal por poço ao grupo controle e ao grupo tratado com DP. Adicionar um mililitro do meio de cultura celular normal suplementado com ácido palmítico 300 micromolares ao grupo tratado com PA e PA mais DP. Após 24 horas de incubação, retirar o meio de cultura das células e, em seguida, lavar as células com um mililitro de meio livre de soro duas vezes.
Em seguida, adicionar um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com um veículo para o grupo controle e um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com um micromolar platicodina D para o grupo tratado com DP. Adicionar um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com 300 micromolares de ácido palmítico ao grupo tratado com PA e um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com 300 micromolares de ácido palmítico e um micromolar platicodina D ao grupo tratado com PA mais DP. Depois de tratar as células por 24 horas, lave as células com um mililitro de 1X PBS por poço três vezes.
Em seguida, corar as células com 100 microlitros de 10 micromolares DCFH-DA por poço. Incubar as células no escuro por 30 minutos. Após a incubação, lave as células com 1X PBS três vezes e adicione um mililitro de 1X PBS a cada poço.
Coloque a placa de 12 poços no palco do microscópio e use uma objetiva de 20X para observar a morfologia das células em aumento de 200X. Para medir o potencial de membrana mitocondrial, lave as células tratadas preparadas anteriormente com um mililitro de 1X PBS por poço três vezes. Em seguida, core as células com 100 microlitros de cinco microgramas por mililitro de solução de trabalho JC-1 e incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro.
Em seguida, lave as células com 1X PBS três vezes e adicione um mililitro de 1X PBS a cada poço. Coloque a placa de 12 poços no palco do microscópio e use uma objetiva de 20X para observar a morfologia das células em aumento de 200X. Lise as células tratadas e colete o lisado celular em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar os tubos a 12.000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 5X SDS-PAGE buffer de carregamento de amostra ao sobrenadante de lisado celular em uma proporção de volume de um para quatro. Em seguida, coloque o gel preparado a 12% SDS-PAGE com 12 poços no tanque de eletroforese e adicione 1X SDS até o tampão de amostra diluído com água ultrapura até o limite de altura recomendado.
Após eletroforese em SDS-PAGE, realizar a eletrotransferência das proteínas para uma membrana de PVDF de 0,45 mícron. Incubar a membrana em cinco mililitros dos anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio. Use anticorpos específicos para LC-III, p62 e beta-actina.
Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, incubar a membrana de PVDF com o anticorpo secundário LGG HRP de coelho anti-camundongo diluído de um a 10.000 em tampão de bloqueio. Incubar a membrana à temperatura ambiente protegida da luz durante duas horas.
Após a incubação, coloque a membrana de PVDF sobre um filme plástico. Adicione uma quantidade adequada de solução de trabalho ECL e incube por dois minutos. Em seguida, remova a solução de trabalho ECL e exponha a membrana PVDF no sistema de imagem para o desenvolvimento da imagem.
A coloração DCFH-DA mostrou que a platicodina D pode reduzir significativamente o nível de ROS intracelular nas células ALM-12, indicando que este tratamento pode reduzir o estresse oxidativo celular. Além disso, a fluorescência verde representando monômeros JC-1 ou mitocôndrias despolarizadas foi maior nas células tratadas com ácido palmítico do que nas células não tratadas, enquanto a fluorescência vermelha representando os dímeros JC-1 ou mitocôndrias polarizadas foi menor nas células tratadas com ácido palmítico do que nas células não tratadas, indicando despolarização de MMP induzida pelo ácido palmítico. Além disso, em comparação com o grupo modelo, a proporção de monômeros JC-1 para dímeros diminuiu no grupo de tratamento platicodina D, indicando que poderia melhorar a MMP induzida pelo ácido palmítico.
Os níveis de expressão proteica das proteínas LC-III e p62 relacionadas à autofagia foram investigados por western blotting. A relação de CL-32 para LC-31 diminuiu significativamente e o nível de expressão proteica de p62 aumentou após o tratamento com ácido palmítico. Por outro lado, a platicodina D reduziu significativamente o nível de expressão proteica de p62 e aumentou a relação LC-32 para LC-31, indicando restauração do fluxo autofágico induzido pelo ácido palmítico.
Se o valor de fluorescência das células do grupo controle negativo for relativamente alto, as concentrações de trabalho das sondas fluorescentes podem ser ajustadas conforme necessário.
