Bu yöntem, model yapımına ve platikodin D'nin NAFLD üzerindeki koruyucu etkilerinin araştırılmasına izin verecek AML-12 hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Hayvan modellerinin kullanımına aşırı bağımlılık, terapötik ilaç geliştirme yükünde artmaktadır. NAFLD ilaç geliştirmenin erken aşamasında hücre modellerinin kullanılması daha pratik ve uygun maliyetlidir.
Bu TCM modeli, platikodin D'nin biyolojik fonksiyonunun anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olabilir ve NAFLD tedavisi için diğer TCM'lerin kullanımını incelemeye yardımcı olabilir. 12 delikli plakalarda kuyu başına bir mililitre AML-12 hücresi ekerek başlayın. Daha sonra 12 kuyucuklu plakayı dört farklı tedavi grubuna bölün ve bunları kontrol, PD ile tedavi edilen, PA ile tedavi edilen ve PA artı PD ile tedavi edilen grup olarak etiketleyin.
Kontrole ve PD ile tedavi edilen gruba kuyu başına bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. PA ile tedavi edilen ve PA artı PD ile tedavi edilen gruba 300 mikromolar palmitik asit ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamının bir mililitresini ekleyin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin kültür ortamını çıkarın ve ardından hücreleri iki kez bir mililitre serumsuz ortamla yıkayın.
Daha sonra, kontrol grubuna bir araçla desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ve PD ile tedavi edilen gruba bir mikromolar platikodin D ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. PA artı PD ile tedavi edilen gruba 300 mikromolar palmitik asit ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ve 300 mikromolar palmitik asit ve bir mikromolar platikodin D ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi ettikten sonra, hücreleri üç kez kuyucuk başına bir mililitre 1X PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre 10 mikromolar DCFH-DA ile boyayın. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri üç kez 1X PBS ile yıkayın ve her bir oyuğa bir mililitre 1X PBS ekleyin.
12 kuyucuklu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hücrelerin morfolojisini 200X büyütmede gözlemlemek için 20X hedefi kullanın. Mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için, daha önce hazırlanan tedavi edilmiş hücreleri kuyucuk başına bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri mililitre JC-1 çalışma çözeltisi başına 100 mikrolitre beş mikrogram ile lekeleyin ve hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra hücreleri üç kez 1X PBS ile yıkayın ve her bir oyuğa bir mililitre 1X PBS ekleyin. 12 kuyucuklu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hücrelerin morfolojisini 200X büyütmede gözlemlemek için 20X hedefi kullanın. Tedavi edilen hücreleri lize edin ve hücre lizatını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
Tüpleri 12.000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, hücre lizat süpernatantına bir ila dört hacim oranında 5X SDS-PAGE numune yükleme tamponu ekleyin. Daha sonra, hazırlanan% 12 SDS-PAGE jelini 12 kuyucuklu elektroforez tankına yerleştirin ve önerilen yükseklik sınırına ultra saf su ile seyreltilmiş 1X SDS yukarı numune tamponu ekleyin.
SDS-PAGE elektroforezinden sonra, proteinlerin 0.45 mikron PVDF membrana elektro transferini gerçekleştirin. Membranı, bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikorların beş mililitresinde inkübe edin. LC-III, p62 ve beta-aktin için spesifik antikorlar kullanın.
Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra PVDF membranını, bloke edici tamponda bir ila 10.000 arasında seyreltilmiş tavşan anti-fare LGG HRP ikincil antikoru ile inkübe edin. Membranı iki saat boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, PVDF membranını plastik bir sargı üzerine yerleştirin. Uygun miktarda ECL çalışma çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca inkübe edin. Ardından ECL çalışma solüsyonunu çıkarın ve görüntü geliştirme için görüntüleme sistemindeki PVDF membranını açığa çıkarın.
DCFH-DA boyaması, platikodin D'nin ALM-12 hücrelerindeki hücre içi ROS seviyesini önemli ölçüde azaltabileceğini ve bu tedavinin hücresel oksidatif stresi azaltabileceğini göstermiştir. Dahası, JC-1 monomerlerini veya depolarize mitokondrileri temsil eden yeşil floresan, palmitik asitle muamele edilen hücrelerde tedavi edilmemiş hücrelerden daha yüksekken, JC-1 dimerlerini veya polarize mitokondrileri temsil eden kırmızı floresan, palmitik asitle muamele edilen hücrelerde, tedavi edilmemiş hücrelerden daha düşüktü ve bu da palmitik asit kaynaklı MMP depolarizasyonunu gösteriyordu. Ek olarak, model grubuyla karşılaştırıldığında, JC-1 monomerlerinin dimerlere oranı, platikodin D tedavi grubunda azalmıştır, bu da palmitik asit kaynaklı MMP'yi iyileştirebileceğini göstermektedir.
Otofaji ile ilişkili proteinler LC-III ve p62'nin protein ekspresyon düzeyleri batı lekelenmesi ile araştırıldı. LC-32'nin LC-31'e oranı önemli ölçüde azaldı ve palmitik asit ile muamele edildikten sonra p62'nin protein ekspresyon seviyesi arttı. Öte yandan, platikodin D, p62'nin protein ekspresyon seviyesini önemli ölçüde azalttı ve LC-32'nin LC-31'e oranını arttırdı, bu da palmitik asit tarafından indüklenen otofajik akının restorasyonunu gösterdi.
Negatif kontrol grubundaki hücrelerin floresan değeri nispeten yüksekse, floresan probların çalışma konsantrasyonları gerektiğinde ayarlanabilir.
