שיטה זו מדגימה את השימוש בתאי AML-12 אשר יאפשרו בניית מודל וחקירת ההשפעות המגינות של platycodin D על NAFLD. הסתמכות יתר על שימוש במודלים של בעלי חיים מגדילה את נטל פיתוח התרופות הטיפוליות. שימוש במודלים תאיים בשלב המוקדם של פיתוח תרופות NAFLD הוא מעשי יותר וחסכוני יותר.
מודל TCM זה עשוי לסייע בשיפור ההבנה של התפקוד הביולוגי של platycodin D ולסייע בחקר השימוש ב-TCM אחרים לטיפול ב-NAFLD. התחל על ידי זריעת מיליליטר אחד של תאי AML-12 לכל באר בלוחות 12 באר. לאחר מכן חלקו את צלחת 12 הבארות לארבע קבוצות טיפול שונות ותייגו אותן כקבוצת ביקורת, טופלה במחלת פרקינסון, טופלה ברשות הפלסטינית והקבוצה שטופלה ב-PA בתוספת פרקינסון.
הוסף מיליליטר אחד של מצע תרבית התאים הרגיל לכל באר לקבוצת הביקורת ולקבוצה שטופלה בפרקינסון. הוסף מיליליטר אחד של מצע תרבית התאים הרגיל בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית וב- PA בתוספת PD שטופלה. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את המדיום התרבית של התאים ולאחר מכן לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיה ללא סרום פעמיים.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת רכב לקבוצת הביקורת ומיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת פלטיקודין D מיקרומולרי אחד לקבוצה שטופלה בפרקינסון. הוסף מיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 מיקרומולרית לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית ומיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 מיקרומולרית ופלטיקודין D מיקרומולרי אחד לקבוצה שטופלה ב- PA בתוספת PD. לאחר טיפול בתאים במשך 24 שעות, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר שלוש פעמים.
ואז להכתים את התאים עם 100 מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי DCFH-DA לכל באר. לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 1X PBS שלוש פעמים ולהוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר.
הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ והשתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים בהגדלה של פי 200. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, שטפו את התאים המטופלים שהוכנו קודם לכן עם מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר שלוש פעמים. לאחר מכן להכתים את התאים עם 100 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר JC-1 פתרון עבודה לדגור את התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן שטפו את התאים עם 1X PBS שלוש פעמים והוסיפו מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר. הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ והשתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים בהגדלה של פי 200. לפרק את התאים המטופלים ולאסוף את התא lysate לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף מאגר טעינת דגימות של 5X SDS-PAGE לסופרנאטנט ליזט התא ביחס נפח של אחד עד ארבעה. לאחר מכן, הכניסו את הג'ל המוכן 12%SDS-PAGE עם 12 בארות למיכל האלקטרופורזה והוסיפו 1X SDS מעלה חיץ דגימה מהולל במים טהורים במיוחד למגבלת הגובה המומלצת.
לאחר אלקטרופורזה SDS-PAGE, בצע את העברת האלקטרו של החלבונים לקרום PVDF של 0.45 מיקרון. לדגור על הממברנה בחמישה מיליליטר של הנוגדנים הראשוניים המדוללים בחיץ חוסם. השתמש בנוגדנים ספציפיים עבור LC-III, p62 ובטא-אקטין .
דוגרים לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לדגור על קרום PVDF עם נוגדן משני LGG HRP נגד עכבר ארנב מדולל אחד עד 10, 000 בחיץ חוסם. לדגור על הממברנה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור במשך שעתיים.
לאחר הדגירה, מניחים את קרום PVDF על ניילון נצמד. מוסיפים כמות מתאימה של פתרון עבודה ECL ודגרים במשך שתי דקות. לאחר מכן הסר את פתרון העבודה ECL וחשף את קרום PVDF במערכת ההדמיה לפיתוח תמונה.
צביעת DCFH-DA הראתה כי פלטיקודין D יכול להפחית באופן משמעותי את רמת ה-ROS התוך-תאי בתאי ALM-12, מה שמצביע על כך שטיפול זה יכול להפחית את העקה החמצונית התאית. יתר על כן, הפלואורסצנטיות הירוקה המייצגת מונומרים JC-1 או מיטוכונדריה דה-פולריים הייתה גבוהה יותר בתאים שטופלו בחומצה פלמיטית מאשר בתאים שלא טופלו, בעוד שהפלואורסצנטיות האדומה שייצגה את דימרים JC-1 או מיטוכונדריה מקוטבת הייתה נמוכה יותר בתאים שטופלו בחומצה פלמיטית מאשר בתאים שלא טופלו, מה שמצביע על דפולריזציה MMP הנגרמת על ידי חומצה פלמיטית. בנוסף, בהשוואה לקבוצת המודל, היחס בין מונומרים JC-1 לדימרים ירד בקבוצת הטיפול בפלטיקודין D, מה שמצביע על כך שהוא יכול לשפר את MMP המושרה על ידי חומצה פלמיטית.
רמות ביטוי החלבונים של חלבונים הקשורים לאוטופגיה LC-III ו-p62 נחקרו על ידי Western Blotting. היחס בין LC-32 ל-LC-31 ירד משמעותית ורמת ביטוי החלבון של p62 עלתה לאחר הטיפול בחומצה פלמיטית. מצד שני, platycodin D הפחית באופן משמעותי את רמת ביטוי החלבון של p62 והגדיל את היחס של LC-32 ל LC-31, מה שמצביע על שחזור השטף האוטופגי המושרה על ידי חומצה פלמיטית.
אם הערך הפלואורסצנטי של התאים בקבוצת הביקורת השלילית גבוה יחסית, ניתן להתאים את ריכוזי העבודה של הגשושיות הפלואורסצנטיות לפי הצורך.
