测量体外分化的离体小鼠脂肪组织和原代前脂肪细胞的脂肪分解率

该协议详细说明了培养的脂肪细胞或离体脂肪组织中脂肪细胞脂肪分解率的测定，允许比较小鼠模型或治疗之间的脂解率。该协议使用串行采样，允许内部验证线性阶段正在测量脂肪分解并减少测量误差。通过优化，该协议可用于测量棕色脂肪组织，来自其他生物体的脂肪组织或脂肪细胞系中的脂肪分解。

离体组织必须切成大小和形状一致的小块，以便BSA在培养基中隔离释放的游离脂肪酸。首先，通过将 5 克牛血清白蛋白或 BSA 溶解在 100 毫升不含酚红的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中来制备 5% BSA 培养基。轻轻搅拌溶液以溶解BSA。

然后制备工作浓度的控制和刺激介质。使用前，请将介质加热至 37 摄氏度。标记用于培养基收集的 96 孔板。

在无菌通风橱内，对100%汇合的原代前脂肪细胞进行分离和分化。每两到三天更换含有胰岛素的培养基，保持每孔一毫升的体积。在本研究中，仅使用分化率高于90%且各组相似的培养物。

然后在测量脂解之前将细胞在无胰岛素培养基中培养24小时。用DPBS洗涤细胞一次，以去除培养基中的残留血清。准备一个48孔板，每次重复一个孔。

将400微升室温DMEM放入每个孔中以供使用。每只小鼠每个组织使用两到四个对照和两到四个刺激孔。准备一个六孔板，每个组织都有一个孔，用于从每只小鼠收集的每个组织，并在每个孔中放入四毫升室温DMEM以供使用。

将收集的性腺脂肪组织放入六孔板中。从孔中取出组织。将其放在硅胶垫上，用剪刀将其切成五到七毫克的块。

用干净的毛巾吸干纸巾以去除任何介质。然后称量25至30毫克，相当于5或6个组织块，用于每个测定孔，并将它们放入先前制备的48孔测定板中。取出组织后称量重量船，并记录留下的任何残留物的重量。

在样品之间擦拭配重船，必要时重新撕裂。为每张纸巾使用新的配重船。称量所有组织样品后，将48孔测定板置于37摄氏度的培养箱中，在10%二氧化碳下放置15分钟。

在无菌通风橱中进行培养基收集。在零时间，去除培养基后，每孔加入400微升对照或刺激培养基，并将测定板放入37摄氏度和10%二氧化碳的培养箱中。对于离体组织培养，使用移液器小心地取出培养基，避免抽吸。

有时在一、二、三和四个小时，收集 200 微升培养基，用 200 微升适当的对照或刺激培养基替换，然后将测定板送回培养箱。将收集板存放在四摄氏度。解冻并混合样品。

将试剂加热至室温，使用一瓶溶剂A溶解一瓶颜色试剂A，使用一瓶溶剂B溶解一瓶颜色试剂B.创建游离脂肪酸或FFA标准曲线后，将标准品和样品移液到96孔测定板中。推荐的样品体积为每孔10微升。向每个孔中加入150微升试剂A并混合。

将测定板在37摄氏度下孵育五分钟。读取板在550纳米和660纳米处的吸光度，并将其称为读数A.向每个孔中加入75微升试剂B并混合。将测定板在37摄氏度下孵育五分钟。

然后从培养箱中取出板后，再次读取板在550和660纳米处的吸光度。将此读数称为读数B.用36升超纯水复溶游离甘油试剂并使其适应室温。解冻并混合样品。

通过对甘油标准溶液和水空白进行7.2倍连续稀释来创建甘油标准曲线。将每种标准品和样品移液25微升到96孔测定板中。向每个孔中加入175微升游离甘油试剂并混合。

将测定板在37摄氏度下孵育五分钟。从培养箱中取出板后，读取板在540纳米处的吸光度。按照文本中描述的步骤计算相应 R 平方值中的脂解率。

然后，使用每个样品的FFA和甘油生产率作为单独的数据点，执行统计分析，并在比较不同的脂解率时绘制值。如果比较不同基因型的离体脂解率，则使用每只动物两个或三个样本作为技术重复，并使用每只动物一个数据点的平均值，以使样本量等于动物的数量。然后对数据进行统计分析。

在四小时的测定中，体外分化的前脂肪细胞中的FFA和甘油产生是线性的。刺激的脂解率显著高于基础率。在受刺激的细胞中，FFA与甘油的摩尔比约为3，表明甘油三酯脂肪分解没有显着的再摄取或保留。

在未受刺激的细胞中，该比例约为1，表明甘油的非脂解来源。在离体培养中，具有较低表面积与体积比的较大组织块表现出较高的FFA保留，导致较低的FFA与甘油摩尔比。在25毫克的组织块中，FFA保留对脂解速率产生负面影响。

非常小的组织块也表现出降低的脂解率。培养基中BSA的减少显着降低了FFA和甘油的释放。刺激24小时后，5%BSA培养基中的FFA积累为5毫摩尔，而0.5%BSA培养基的FFA积累仅为0.6毫摩尔。

收集的培养基中的FFA水平在三小时内达到2.3毫摩尔的危险区域。4小时时培养基FFA和甘油缺乏增加表明反馈抑制。排除四小时的时间点导致释放率略有但显着增加。

即使在通常的时间点之间，FFA的释放速率也是线性的。从离体脂肪分解样品中取出培养基时，重要的是要确保移液器不会意外去除组织块。可能需要测量这些样品中的蛋白质或脂质含量，以使结果正确归一化。