Dieses Protokoll beschreibt die Bestimmung der Rate der Adipozytenlipolyse in kultivierten Adipozyten oder ex vivo Fettgewebe und ermöglicht den Vergleich der lipolytischen Raten zwischen murinen Modellen oder Behandlungen. Dieses Protokoll verwendet serielle Abtastung, die es ermöglicht, intern zu überprüfen, ob die Lipolyse in der linearen Phase gemessen wird, und den Messfehler zu reduzieren. Mit Optimierung kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Lipolyse in braunem Fettgewebe, Fettgewebe anderer Organismen oder adipogenen Zelllinien zu messen.
Ex-vivo-Gewebe müssen in kleine Stücke von gleichbleibender Größe und Form zerkleinert werden, um die Sequestrierung der freigesetzten freien Fettsäuren durch BSA im Medium zu ermöglichen. Bereiten Sie zunächst das 5%ige BSA-Medium vor, indem Sie fünf Gramm Bovine Serum Albumin (BSA) in 100 Millilitern Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ohne Phenolrot auflösen. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um, um das BSA aufzulösen.
Bereiten Sie dann Arbeitskonzentrationen von Kontroll- und Stimulationsmedien vor. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius. Beschriften Sie eine 96-Well-Platte für die Mediensammlung.
Führen Sie in einem sterilen Abzug eine Isolierung und Differenzierung von 100% konfluenten primären Präadipozyten durch. Wechseln Sie alle zwei bis drei Tage das insulinhaltige Nährmedium unter Beibehaltung eines Volumens von einem Milliliter pro Well. Verwenden Sie für diese Studie nur Kulturen mit Differenzierungsraten von über 90 % und ähnlichen Gruppen.
Kultivieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang in insulinfreien Medien, bevor Sie die Lipolyse messen. Waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, um Serumreste aus dem Nährmedium zu entfernen. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte mit einer Well für jedes Replikat vor.
Geben Sie 400 Mikroliter DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung. Verwenden Sie zwei bis vier Kontroll- und zwei bis vier stimulierte Vertiefungen pro Gewebe und Maus. Bereiten Sie eine Sechs-Well-Platte mit einer Vertiefung für jedes Gewebe vor, das von jeder Maus entnommen werden soll, und geben Sie vier Milliliter DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung.
Legen Sie das gesammelte Gonadenfettgewebe in die Sechs-Well-Platte. Entfernen Sie das Gewebe aus der Vertiefung. Legen Sie es auf eine Silikonmatte und schneiden Sie es mit einer Schere in fünf bis sieben Milligramm große Stücke.
Tupfen Sie die Taschentücher auf ein sauberes Handtuch, um alle Medien zu entfernen. Wiegen Sie dann 25 bis 30 Milligramm, was fünf oder sechs Gewebestücken entspricht, für jede Assay-Vertiefung ab und legen Sie sie in die zuvor vorbereitete 48-Well-Assay-Platte. Wiegen Sie das Gewichtsboot, nachdem Sie die Taschentücher entfernt haben, und notieren Sie das Gewicht aller zurückgebliebenen Rückstände.
Wischen Sie das Gewichtsboot zwischen den Proben sauber und reißen Sie es bei Bedarf wieder auf. Verwenden Sie für jedes Gewebe ein neues Gewichtsschiffchen. Sobald alle Gewebeproben gewogen wurden, legen Sie die 48-Well-Assay-Platte für 15 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 10 % Kohlendioxid.
Führen Sie die Medienentnahme in einem sterilen Abzug durch. Zum Zeitpunkt Null, nachdem Sie das Medium entfernt haben, fügen Sie 400 Mikroliter Kontroll- oder Stimulationsmedium pro Vertiefung hinzu und stellen Sie die Assay-Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid. Bei Ex-vivo-Gewebekulturen ist das Medium vorsichtig mit einer Pipette zu entfernen und eine Absaugung zu vermeiden.
Sammeln Sie zeitweise eine, zwei, drei und vier Stunden 200 Mikroliter Medien, ersetzen Sie sie durch 200 Mikroliter des entsprechenden Kontroll- oder Stimulationsmediums und geben Sie die Testplatte wieder in den Inkubator zurück. Lagern Sie den Auffangteller bei vier Grad Celsius. Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.
Erwärmen Sie die Reagenzien auf Raumtemperatur und lösen Sie eine Flasche Farbreagenz A mit einer Flasche Lösungsmittel A und eine Flasche Farbreagenz B mit einer Flasche Lösungsmittel B auf.Nachdem Sie eine Kurve für freie Fettsäuren oder FFA erstellt haben, pipettieren Sie Standards und Proben in eine 96-Well-Assay-Platte. Das empfohlene Probenvolumen beträgt 10 Mikroliter pro Well. Geben Sie 150 Mikroliter Reagenz A in jede Vertiefung und mischen Sie.
Inkubieren Sie die Assay-Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 550 Nanometern und 660 Nanometern ab und bezeichnen Sie dies als Messwert A.Geben Sie 75 Mikroliter Reagenz B in jede Vertiefung und mischen Sie. Inkubieren Sie die Assay-Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator genommen haben, lesen Sie die Absorption der Platte erneut bei 550 und 660 Nanometern ab. Beziehen Sie sich auf diese Ablesung als Lektüre B.Rekonstituieren Sie das freie Glycerinreagenz mit 36 Litern Reinstwasser und akklimatisieren Sie es auf Raumtemperatur. Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.
Erstellen Sie eine Glycerin-Standardkurve, indem Sie eine 7,2-fache serielle Verdünnung der Glycerin-Standardlösung und eines Wasserblindlings vornehmen. Pipettieren Sie 25 Mikroliter jedes Standards und der Proben in die 96-Well-Assay-Platte. Geben Sie 175 Mikroliter freies Glycerinreagenz in jede Vertiefung und mischen Sie.
Inkubieren Sie die Assay-Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator genommen haben, lesen Sie die Absorption der Platte bei 540 Nanometern ab. Befolgen Sie die im Text beschriebenen Schritte, um die lipolytischen Raten in den jeweiligen R-Quadrat-Werten zu berechnen.
Führen Sie dann die FFA- und Glycerinproduktionsraten für jede Probe als individuellen Datenpunkt durch, führen Sie statistische Analysen durch und zeichnen Sie die Werte auf, wenn verschiedene lipolytische Raten verglichen werden. Wenn Sie die lipolytischen Ex-vivo-Raten verschiedener Genotypen vergleichen, verwenden Sie zwei oder drei Proben pro Tier als technische Replikate und verwenden Sie den Durchschnitt für einen Datenpunkt pro Tier, so dass die Stichprobengröße gleich der Anzahl der Tiere ist. Führen Sie dann eine statistische Analyse mit den Daten durch.
Die FFA- und Glycerinproduktion in den in vitro differenzierten Präadipozyten war während des vierstündigen Assays linear. Die stimulierten lipolytischen Raten waren signifikant höher als die basalen Raten. In stimulierten Zellen betrug das molare Verhältnis von FFA zu Glycerin etwa drei, was auf eine Triglycerid-Lipolyse ohne signifikante Wiederaufnahme oder Retention hinweist.
In den unstimulierten Zellen lag das Verhältnis bei etwa eins, was auf eine nicht-lipolytische Glycerinquelle hindeutet. In Ex-vivo-Kulturen wiesen größere Gewebestücke mit einem geringeren Verhältnis von Oberfläche zu Volumen eine höhere FFA-Retention auf, was zu einem niedrigeren molaren Verhältnis von FFA zu Glycerin führte. In den 25-Milligramm-Gewebestücken wirkte sich die FFA-Retention negativ auf die Lipolyseraten aus.
Sehr kleine Gewebebrocken wiesen ebenfalls reduzierte lipolytische Raten auf. Die Reduktion von BSA im Medium reduzierte sowohl die FFA- als auch die Glycerinfreisetzung signifikant. Die FFA-Akkumulation in den 5%-BSA-Medien nach 24-stündiger Stimulation betrug fünf Millimolar, während die des 0,5%-BSA-Mediums nur 0,6 Millimolaren betrug.
Die FFA-Konzentrationen in den gesammelten Medien erreichten innerhalb von drei Stunden den Gefahrenbereich von 2,3 Millimol. Der fehlende Anstieg der Medien FFA und Glycerin nach vier Stunden deutete auf eine Rückkopplungshemmung hin. Der Ausschluss des Vier-Stunden-Zeitpunkts führte zu einem kleinen, aber signifikanten Anstieg der Release-Raten.
Die Rate der FFA-Freigabe war linear, selbst zwischen den üblichen Zeitpunkten. Bei der Entnahme von Medien aus den Ex-vivo-Lipolyseproben ist darauf zu achten, dass die Gewebestücke nicht versehentlich von der Pipette entfernt werden. Es kann notwendig sein, den Protein- oder Lipidgehalt in diesen Proben zu messen, um die Ergebnisse richtig zu normalisieren.
