このプロトコルは、培養脂肪細胞またはex vivo脂肪組織における脂肪細胞脂肪分解の速度の決定を詳述し、マウスモデルまたは治療間の脂肪分解速度の比較を可能にします。このプロトコルはシリアルサンプリングを使用しているため、脂肪分解が線形相で測定されていることを内部で検証でき、測定誤差を低減できます。最適化により、このプロトコルを使用して、褐色脂肪組織、他の生物の脂肪組織、または脂肪生成細胞株の脂肪分解を測定することができます。
生体外組織は、培地中のBSAによって放出された遊離脂肪酸の隔離を可能にするために、一貫したサイズと形状の小さな塊に切り刻まれなければなりません。まず、フェノールレッドを含まない100ミリリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に5グラムのウシ血清アルブミン(BSA)を溶解して、5%BSA培地を調製します。溶液を静かに攪拌してBSAを溶解します。
次に、制御および刺激媒体の使用濃度を準備します。使用する前に、メディアを摂氏37度に温めてください。培地収集用に96ウェルプレートにラベルを付けます。
滅菌ヒュームフード内で、100%コンフルエントな初代脂肪前駆細胞の単離と分化を行います。2〜3日ごとに、1ウェルあたり1ミリリットルの容量を維持するインスリンを含む培養培地を交換する。この研究では、分化率が90%を超え、グループ間で類似している培養のみを使用します。
次に、脂肪分解を測定する前に、インスリンを含まない培地で細胞を24時間培養します。細胞をDPBSで一度洗浄し、培地から残留血清を除去します。反復ごとに1ウェルの48ウェルプレートを準備します。
使用する各ウェルに400マイクロリットルの室温DMEMを入れます。マウス1匹あたり組織あたり2〜4個のコントロールウェルと2〜4個の刺激ウェルを使用します。各マウスから採取する組織ごとに1ウェルを有する6ウェルプレートを準備し、使用する各ウェルに4ミリリットルの室温DMEMを入れます。
採取した性腺脂肪組織を6ウェルプレートに入れます。ウェルから組織を取り除きます。シリコンマットの上に置き、ハサミで5〜7ミリグラムの塊に切ります。
清潔なタオルでティッシュを拭き取り、メディアを取り除きます。次に、各アッセイウェルについて、5つまたは6つの組織チャンクに相当する25〜30ミリグラムの重量を量り、事前に準備した48ウェルアッセイプレートに入れます。ティッシュを取り除いた後、ウェイトボートの重量を量り、残った残留物の重量を記録します。
サンプル間でウェイトボートをきれいに拭き、必要に応じて引き裂きます。組織ごとに新しいウェイトボートを使用してください。すべての組織サンプルの重量を測定したら、48ウェルアッセイプレートを摂氏37度のインキュベーターに10%二酸化炭素下で15分間置きます。
滅菌ヒュームフードで培地収集を行います。時間0で、培地を除去した後、ウェルあたり400マイクロリットルのコントロールまたは刺激培地を追加し、アッセイプレートを摂氏37度および10%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。ex vivo組織培養の場合は、ピペットを使用して培地を慎重に除去し、吸引を加えないでください。
1時間、2時間、3時間、4時間で、200マイクロリットルの培地を回収し、200マイクロリットルの適切なコントロールまたは刺激培地と交換し、アッセイプレートをインキュベーターに戻します。収集プレートは摂氏4度で保管してください。サンプルを解凍して混合します。
試薬を室温に温め、溶媒A1本を使用してカラー試薬Aボトル1本、溶媒Bボトル1本を使用してカラー試薬Bボトル1本を溶解します遊離脂肪酸またはFFA標準曲線を作成した後、ピペット標準物質とサンプルを96ウェルアッセイプレートに入れます。推奨サンプル量はウェルあたり10マイクロリットルです。150マイクロリットルの試薬Aを各ウェルに加え、混合する。
アッセイプレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。550ナノメートルと660ナノメートルのプレートの吸光度を読み取り、これを読み取りAと呼びます.各ウェルに75マイクロリットルの試薬Bを加えて混合します。アッセイプレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、プレートをインキュベーターから取り出した後、550ナノメートルと660ナノメートルでのプレートの吸光度を再度読み取ります。この測定値は、B.遊離グリセロール試薬を36リットルの超純水で再構成し、室温に順応させるという読み方を参照してください。サンプルを解凍して混合します。
グリセロール標準溶液と水ブランクの7.2倍の段階希釈を行うことにより、グリセロール標準曲線を作成します。各標準物質25マイクロリットルをピペットし、96ウェルアッセイプレートにサンプルを注入する。175マイクロリットルの遊離グリセロール試薬を各ウェルに加えて混合する。
アッセイプレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出した後、540ナノメートルでのプレートの吸光度を読み取ります。本文に記載されている手順に従って、それぞれのR2乗値の脂肪分解率を計算します。
次に、各サンプルのFFAおよびグリセロール産生速度を個々のデータポイントとして使用して、統計分析を実行し、異なる脂肪分解率が比較されている場合は値をプロットします。遺伝子型間でex vivo脂肪分解率を比較する場合は、技術的な反復として動物あたり2つまたは3つのサンプルを使用し、サンプルサイズが動物の数と等しくなるように、動物ごとに1つのデータポイントの平均を使用します。次に、データを使用して統計分析を実行します。
in vitroで分化した脂肪前駆細胞におけるFFAおよびグリセロール産生は、4時間のアッセイ中に直線的であった。刺激脂肪分解率は基礎率よりも有意に高かった。刺激された細胞では、FFAとグリセロールのモル比は約3であり、有意な再取り込みまたは保持のないトリグリセリド脂肪分解を示しました。.
刺激されていない細胞では、その比率は約1であり、グリセロールの非脂肪分解源を示唆しています。ex vivo培養では、表面積対体積比が低いより大きな組織チャンクは、より高いFFA保持を示し、その結果、FFA対グリセロールモル比が低くなりました。25ミリグラムの組織チャンクでは、FFAの保持が脂肪分解の速度に悪影響を及ぼしました。
非常に小さな組織チャンクも脂肪分解率の低下を示しました。培地中のBSAの減少は、FFAおよびグリセロール放出の両方を有意に減少させた。24時間刺激後の5%BSA培地のFFA蓄積は5ミリモルであったが,0.5%BSA培地の蓄積はわずか0.6ミリモルであった。
採取した培地のFFAレベルは、3時間で2.3ミリモルの危険ゾーンに達しました。4時間後の培地FFAおよびグリセロールの増加の欠如は、フィードバック阻害を示唆した。4時間の時点を除外すると、リリース率がわずかではあるが大幅に増加しました。
FFA放出の速度は、通常の時点間でも線形であった。ex vivo脂肪分解サンプルから培地を除去する場合、組織の塊がピペットによって誤って除去されないようにすることが重要です。結果を適切に正規化するには、これらのサンプルのタンパク質または脂質含有量を測定する必要がある場合があります。
