Este protocolo detalla la determinación de la tasa de lipólisis de adipocitos en adipocitos cultivados o tejido adiposo ex vivo, permitiendo la comparación de tasas lipolíticas entre modelos murinos o tratamientos. Este protocolo utiliza muestreo en serie, que permite validar internamente que la lipólisis se mide en la fase lineal y reduce el error de medición. Con la optimización, este protocolo se puede utilizar para medir la lipólisis en tejido adiposo marrón, tejido adiposo de otros organismos o líneas celulares adipogénicas.
Los tejidos ex vivo deben cortarse en pequeños trozos de tamaño y forma consistentes para permitir el secuestro de los ácidos grasos libres liberados por BSA en los medios. Para comenzar, prepare el medio BSA al 5% disolviendo cinco gramos de albúmina sérica bovina, o BSA, en 100 mililitros del medio de águila modificada de Dulbecco, o DMEM, sin rojo fenol. Revuelva suavemente la solución para disolver el BSA.
Luego prepare las concentraciones de trabajo de los medios de control y estimulación. Antes de usar, caliente el medio a 37 grados centígrados. Etiquete una placa de 96 pocillos para la recolección de medios.
Dentro de una campana extractora estéril, realizar aislamiento y diferenciación de preadipocitos primarios 100% confluentes. Cada dos o tres días, cambie los medios de cultivo que contienen insulina manteniendo un volumen de un mililitro por pocillo. Para este estudio, use solo cultivos que tengan tasas de diferenciación superiores al 90% y similares en todos los grupos.
Luego cultive las células en medios libres de insulina durante 24 horas antes de medir la lipólisis. Lave las células con DPBS una vez para eliminar el suero residual de los medios de cultivo. Prepare una placa de 48 pocillos con un pocillo para cada réplica.
Coloque 400 microlitros de DMEM a temperatura ambiente en cada pocillo que se utilizará. Use dos a cuatro pocillos de control y de dos a cuatro estimulados por tejido por ratón. Prepare una placa de seis pocillos con un pocillo para cada tejido que se recogerá de cada ratón y ponga cuatro mililitros de DMEM a temperatura ambiente en cada pocillo que se utilizará.
Coloque el tejido adiposo gonadal recogido en la placa de seis pocillos. Retire el tejido del pozo. Colóquelo en una estera de silicona y córtelo en trozos de cinco a siete miligramos con tijeras.
Seque los pañuelos en una toalla limpia para eliminar cualquier medio. Luego pese de 25 a 30 miligramos, equivalentes a cinco o seis trozos de tejido, para cada pocillo de ensayo y colóquelos en la placa de ensayo de 48 pocillos previamente preparada. Pese el bote de pesas después de quitar los pañuelos y registre el peso de cualquier residuo que quede.
Limpie el bote de pesas entre muestras y vuelva a arrancar si es necesario. Use un bote de pesas nuevo para cada tejido. Una vez que se hayan pesado todas las muestras de tejido, coloque la placa de ensayo de 48 pocillos en una incubadora de 37 grados centígrados con menos de dióxido de carbono al 10% durante 15 minutos.
Realice la recolección de medios en una campana extractora estéril. En el momento cero, después de retirar los medios, agregue 400 microlitros de medios de control o estimulación por pocillo y coloque la placa de ensayo en una incubadora a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono. Para el cultivo de tejido ex vivo, retire con cuidado los medios con una pipeta y evite aplicar succión.
A veces, una, dos, tres y cuatro horas, recoja 200 microlitros de medios, reemplácelos con 200 microlitros del medio de control o estimulación apropiados y devuelva la placa de ensayo a la incubadora. Guarde el plato de recolección a cuatro grados centígrados. Descongelar y mezclar las muestras.
Caliente los reactivos a temperatura ambiente y disuelva una botella de reactivo de color A con una botella de disolvente A y una botella de reactivo de color B con una botella de disolvente B.Después de crear una curva estándar de ácido graso libre o FFA, pipetear patrones y muestras en una placa de ensayo de 96 pocillos. El volumen de muestra recomendado es de 10 microlitros por pocillo. Agregue 150 microlitros de reactivo A a cada pocillo y mezcle.
Incubar la placa de ensayo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Lea la absorbancia de la placa a 550 nanómetros y 660 nanómetros y refiérase a esto como lectura A.Agregue 75 microlitros de reactivo B a cada pocillo y mezcle. Incubar la placa de ensayo a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Luego, después de retirar la placa de la incubadora, lea la absorbancia de la placa nuevamente a 550 y 660 nanómetros. Reconstituya el reactivo de glicerol libre con 36 litros de agua ultrapura y aclimatarlo a temperatura ambiente. Descongelar y mezclar las muestras.
Cree una curva estándar de glicerol haciendo una dilución en serie de 7,2 veces de la solución patrón de glicerol y un espacio en blanco. Pipetear 25 microlitros de cada patrón y muestras en la placa de ensayo de 96 pocillos. Agregue 175 microlitros de reactivo de glicerol libre a cada pocillo y mezcle.
Incubar la placa de ensayo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de retirar la placa de la incubadora, lea la absorbancia de la placa a 540 nanómetros. Siga los pasos descritos en el texto para calcular las tasas lipolíticas en los respectivos valores R cuadrado.
Luego, utilizando las tasas de producción de FFA y glicerol para cada muestra como un punto de datos individual, realice un análisis estadístico y trace los valores si se comparan diferentes tasas lipolíticas. Si compara las tasas lipolíticas ex vivo entre genotipos, use dos o tres muestras por animal como réplicas técnicas y use el promedio de un punto de datos por animal para que el tamaño de la muestra sea igual al número de animales. Luego realice un análisis estadístico con los datos.
La producción de FFA y glicerol en los preadipocitos diferenciados in vitro fue lineal durante el ensayo de cuatro horas. Las tasas lipolíticas estimuladas fueron significativamente más altas que las tasas basales. En las células estimuladas, la proporción molar de AGF a glicerol fue de aproximadamente tres, lo que indica lipólisis de triglicéridos sin recaptación o retención significativa.
En las células no estimuladas, la proporción fue de aproximadamente uno, lo que sugiere una fuente no lipolítica de glicerol. En cultivos ex vivo, los trozos de tejido más grandes que tenían una menor relación área de superficie a volumen exhibieron una mayor retención de FFA, lo que resultó en menores proporciones molares de FFA a glicerol. En los trozos de tejido de 25 miligramos, la retención de FFA afectó negativamente las tasas de lipólisis.
Trozos de tejido muy pequeños también exhibieron tasas lipolíticas reducidas. La reducción de BSA en los medios redujo significativamente tanto la liberación de FFA como la de glicerol. La acumulación de FFA en el medio BSA al 5% después de 24 horas de estimulación fue de cinco milimolares, mientras que la del medio BSA al 0,5% fue de solo 0,6 milimolar.
Los niveles de FFA en los medios recolectados alcanzaron la zona de peligro de 2.3 milimolar en tres horas. La falta de aumento en los medios FFA y glicerol a las cuatro horas sugirió inhibición de la retroalimentación. Excluyendo el punto de tiempo de cuatro horas causó un aumento pequeño, pero significativo en las tasas de lanzamiento.
La tasa de liberación de FFA fue lineal incluso entre los puntos de tiempo habituales. Al extraer los medios de las muestras de lipólisis ex vivo, es importante asegurarse de que los trozos de tejido no sean eliminados accidentalmente por la pipeta. Puede ser necesario medir el contenido de proteínas o lípidos en estas muestras para normalizar adecuadamente los resultados.
