Bu protokol, kültürlü adipositlerde veya ex vivo yağ dokusunda adiposit lipoliz oranının belirlenmesini detaylandırarak, murin modelleri veya tedavileri arasında lipolitik oranların karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu protokol, lipolizin doğrusal fazda ölçüldüğünü dahili olarak doğrulamaya izin veren ve ölçüm hatasını azaltan seri örnekleme kullanır. Optimizasyon ile, bu protokol kahverengi yağ dokusunda, diğer organizmalardan yağ dokusunda veya adipojenik hücre hatlarında lipolizi ölçmek için kullanılabilir.
Ex vivo dokular, salınan serbest yağ asitlerinin BSA tarafından ortamda tutulmasına izin vermek için tutarlı boyut ve şekildeki küçük parçalar halinde doğranmalıdır. Başlamak için, beş gram Sığır Serum Albümini veya BSA'yı, 100 mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM'de fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 BSA ortamını hazırlayın. BSA'yı çözmek için çözeltiyi yavaşça karıştırın.
Daha sonra kontrol ve stimülasyon ortamının çalışma konsantrasyonlarını hazırlayın. Kullanmadan önce, medyayı 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Medya koleksiyonu için 96 delikli bir plakayı etiketleyin.
Steril bir duman davlumbazının içinde,% 100 birleşen primer preadipositlerin izolasyonunu ve farklılaşmasını gerçekleştirin. Her iki ila üç günde bir, kuyu başına bir mililitrelik bir hacmi koruyarak insülin içeren kültür ortamını değiştirin. Bu çalışma için, yalnızca gruplar arasında farklılaşma oranları% 90'ın üzerinde ve benzer olan kültürleri kullanın.
Daha sonra lipolizi ölçmeden önce hücreleri 24 saat boyunca insülin içermeyen ortamda kültürleyin. Artık serumu kültür ortamından çıkarmak için hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın. Her çoğaltma için bir kuyucuklu 48 delikli bir plaka hazırlayın.
Kullanılacak her bir kuyucuğa 400 mikrolitre oda sıcaklığında DMEM yerleştirin. Fare başına doku başına iki ila dört kontrol ve iki ila dört uyarılmış kuyucuk kullanın. Her fareden toplanacak her doku için bir kuyucuklu altı kuyucuklu bir plaka hazırlayın ve kullanılacak her bir kuyucuğa dört mililitre oda sıcaklığında DMEM koyun.
Toplanan gonadal yağ dokusunu altı delikli plakaya yerleştirin. Kuyudan dokuyu çıkarın. Silikon bir paspas üzerine yerleştirin ve makasla beş ila yedi miligram parçalara bölün.
Herhangi bir ortamı çıkarmak için dokuları temiz bir havlu üzerinde kurutun. Daha sonra, her bir tahlil için beş veya altı doku parçasına eşdeğer 25 ila 30 miligram ağırlığında olun ve bunları önceden hazırlanmış 48 kuyucuklu tahlil plakasına yerleştirin. Dokuları çıkardıktan sonra ağırlık teknesini tartın ve geride kalan kalıntıların ağırlığını kaydedin.
Numuneler arasında ağırlık teknesini temizleyin ve gerekirse yeniden yırtın. Her doku için yeni bir ağırlık teknesi kullanın. Tüm doku örnekleri tartıldıktan sonra, 48 kuyucuklu tahlil plakasını 15 dakika boyunca% 10 karbondioksit altında 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.
Steril bir duman davlumbazında medya toplama işlemi gerçekleştirin. Sıfır zamanında, ortamı çıkardıktan sonra, kuyu başına 400 mikrolitre kontrol veya stimülasyon ortamı ekleyin ve tahlil plakasını 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. Ex vivo doku kültürü için, pipet kullanarak ortamı dikkatlice çıkarın ve emme uygulamaktan kaçının.
Bazen bir, iki, üç ve dört saat sonra, 200 mikrolitre ortam toplayın, 200 mikrolitre uygun kontrol veya stimülasyon ortamı ile değiştirin ve tahlil plakasını inkübatöre geri gönderin. Toplama plakasını dört santigrat derecede saklayın. Numuneleri çözün ve karıştırın.
Reaktifleri oda sıcaklığına ısıtın ve bir şişe A çözücü kullanarak bir şişe renk reaktifi A ve bir şişe B renk reaktifini bir şişe çözücü kullanarak çözün.Bir serbest yağ asidi veya FFA standart eğrisi, pipet standartları ve numuneleri oluşturduktan sonra 96 kuyucuklu bir tahlil plakasına çözün. Önerilen numune hacmi kuyu başına 10 mikrolitredir. Her bir oyuğa 150 mikrolitre reaktif A ekleyin ve karıştırın.
Tahlil plakasını beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakanın 550 nanometre ve 660 nanometredeki emilimini okuyun ve buna okuma olarak atıfta bulunun A.Her bir kuyucuğa 75 mikrolitre reaktif B ekleyin ve karıştırın. Tahlil plakasını beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, plakanın emilimini tekrar 550 ve 660 nanometrede okuyun. Bu okumaya okuma olarak bakın B.Serbest gliserol reaktifini 36 litre ultra saf su ile yeniden oluşturun ve oda sıcaklığına alıştırın. Numuneleri çözün ve karıştırın.
Gliserol standart çözeltisinin 7.2 kat seri seyreltilmesini ve bir su boşluğunu yaparak bir gliserol standart eğrisi oluşturun. Her standarttan 25 mikrolitre pipet alın ve 96 delikli tahlil plakasına numune alın. Her bir oyuğa 175 mikrolitre serbest gliserol reaktifi ekleyin ve karıştırın.
Tahlil plakasını beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, plakanın emilimini 540 nanometrede okuyun. İlgili R kare değerlerindeki lipolitik oranları hesaplamak için metinde açıklanan adımları izleyin.
Ardından, her numune için FFA ve gliserol üretim oranlarını ayrı bir veri noktası olarak kullanarak, istatistiksel analiz yapın ve farklı lipolitik oranlar karşılaştırılıyorsa değerleri çizin. Genotipler arasında ex vivo lipolitik oranları karşılaştırıyorsanız, teknik kopyalar olarak hayvan başına iki veya üç örnek kullanın ve örneklem büyüklüğünün hayvan sayısına eşit olması için hayvan başına bir veri noktası ortalamasını kullanın. Ardından verilerle istatistiksel analiz yapın.
İn vitro diferansiye preadipositlerde FFA ve gliserol üretimi dört saatlik tahlil sırasında lineer idi. Uyarılmış lipolitik oranlar bazal oranlardan anlamlı olarak daha yüksekti. Uyarılmış hücrelerde, FFA-gliserol molar oranı yaklaşık üç idi, bu da önemli bir geri alım veya retansiyon olmaksızın trigliserit lipolizi gösteriyordu.
Uyarılmamış hücrelerde, oran yaklaşık bir idi, bu da lipolitik olmayan bir gliserol kaynağını düşündürüyordu. İn vivo kültürlerde, daha düşük bir yüzey alanı / hacim oranına sahip daha büyük doku parçaları daha yüksek FFA retansiyonu sergiledi ve bu da daha düşük FFA-gliserol molar oranları ile sonuçlandı. 25 miligramlık doku parçalarında, FFA retansiyonu lipoliz oranlarını olumsuz yönde etkiledi.
Çok küçük doku parçaları da lipolitik oranlarda azalma sergiledi. Medyada BSA'nın azaltılması hem FFA hem de gliserol salınımını önemli ölçüde azaltmıştır. 24 saatlik stimülasyondan sonra% 5 BSA ortamındaki FFA birikimi beş milimolar iken,% 0.5 BSA ortamınınki sadece 0.6 milimolar idi.
Toplanan medyadaki FFA seviyeleri üç saat içinde 2.3 milimolar tehlike bölgesine ulaştı. Dört saatte medya, FFA ve gliserol artışı, geri bildirim inhibisyonunu düşündürmüştür. Dört saatlik zaman noktasının hariç tutulması, serbest bırakma oranlarında küçük ama önemli bir artışa neden oldu.
FFA salınım oranı, normal zaman noktaları arasında bile doğrusaldı. Ex vivo lipoliz numunelerinden ortam çıkarırken, doku parçalarının pipet tarafından yanlışlıkla çıkarılmadığından emin olmak önemlidir. Sonuçları uygun şekilde normalleştirmek için bu örneklerdeki protein veya lipit içeriğini ölçmek gerekebilir.
