Este protocolo detalha a determinação da taxa de lipólise dos adipócitos em cultura de adipócitos ou tecido adiposo ex vivo, permitindo a comparação das taxas lipolíticas entre modelos ou tratamentos murinos. Esse protocolo utiliza amostragem seriada, o que permite validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e reduz o erro de medição. Com otimização, esse protocolo pode ser usado para medir lipólise em tecido adiposo marrom, tecido adiposo de outros organismos ou linhagens de células adipogênicas.
Os tecidos ex vivo devem ser picados em pequenos pedaços de tamanho e forma consistentes para permitir o sequestro dos ácidos gordos livres libertados pela BSA nos meios. Para começar, prepare o meio BSA a 5% dissolvendo cinco gramas de Albumina de Soro Bovino, ou BSA, em 100 mililitros de Meio de Águia Modificado de Dulbecco, ou DMEM, sem vermelho fenol. Mexa suavemente a solução para dissolver a BSA.
Em seguida, prepare concentrações de trabalho de meios de controle e estimulação. Antes de usar, aqueça o meio a 37 graus Celsius. Rotule uma placa de 96 poços para coleta de mídia.
Dentro de uma capela de fumaça estéril, realizar isolamento e diferenciação de pré-adipócitos primários 100% confluentes. A cada dois ou três dias, trocar o meio de cultura contendo insulina mantendo um volume de um mililitro por poço. Para este estudo, utilizar-se-ão apenas culturas com taxas de diferenciação acima de 90% e semelhantes entre os grupos.
Em seguida, cultivar as células em meio livre de insulina por 24 horas antes da dosagem da lipólise. Lavar as células com DPBS uma vez para remover o soro residual dos meios de cultura. Prepare uma placa de 48 poços com um poço para cada réplica.
Coloque 400 microlitros de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado. Use dois a quatro poços de controle e dois a quatro estimulados por tecido por camundongo. Prepare uma placa de seis poços com um orifício para cada tecido a ser coletado de cada camundongo e coloque quatro mililitros de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado.
Coloque o tecido adiposo gonadal coletado na placa de seis poços. Retire o tecido do poço. Coloque em um tapete de silicone e corte em pedaços de cinco a sete miligramas com tesoura.
Coloque os tecidos em uma toalha limpa para remover qualquer meio. Em seguida, pesar de 25 a 30 miligramas, o equivalente a cinco ou seis pedaços de tecido, para cada ensaio bem e colocá-los na placa de ensaio de 48 poços previamente preparada. Pesar o barco de peso após a remoção dos tecidos e registrar o peso de qualquer resíduo deixado para trás.
Limpe o barco de peso entre as amostras e rasgue novamente, se necessário. Use um novo barco de peso para cada tecido. Depois que todas as amostras de tecido tiverem sido pesadas, coloque a placa de ensaio de 48 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius sob 10% de dióxido de carbono por 15 minutos.
Realizar coleta de mídia em um exaustor de fumaça estéril. No tempo zero, após a remoção do meio, adicione 400 microlitros de meio de controle ou de estimulação por poço e coloque a placa de ensaio em uma incubadora a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono. Para cultura de tecidos ex vivo, remova cuidadosamente o meio usando uma pipeta e evite aplicar sucção.
Às vezes, uma, duas, três e quatro horas, coletar 200 microlitros de meio, substituí-lo por 200 microlitros do meio de controle ou estimulação apropriado e retornar a placa de ensaio à incubadora. Guarde a placa coletora a quatro graus Celsius. Descongele e misture as amostras.
Aqueça os reagentes à temperatura ambiente e dissolva um frasco de reagente de cor A usando um frasco de solvente A e um frasco de reagente de cor B usando um frasco de solvente B.Depois de criar uma curva padrão de ácido graxo livre ou FFA, pipeta padrões e amostras em uma placa de ensaio de 96 poços. O volume de amostra recomendado é de 10 microlitros por poço. Adicione 150 microlitros de reagente A a cada poço e misture.
Incubar a placa de ensaio a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Leia a absorbância da placa em 550 nanômetros e 660 nanômetros e consulte isso como leitura A.Adicione 75 microlitros de reagente B a cada poço e misture. Incubar a placa de ensaio a 37 graus Celsius durante cinco minutos.
Em seguida, após remover a placa da incubadora, leia a absorbância da placa novamente a 550 e 660 nanômetros. Consulte esta leitura como leitura B.Reconstitua o reagente glicerol livre com 36 litros de água ultrapura e aclimate-o à temperatura ambiente. Descongele e misture as amostras.
Crie uma curva padrão de glicerol fazendo uma diluição em série de 7,2 vezes da solução padrão de glicerol e um branco de água. Pipetar 25 microlitros de cada padrão e amostras para a placa de ensaio de 96 poços. Adicione 175 microlitros de reagente glicerol livre a cada poço e misture.
Incubar a placa de ensaio a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Depois de remover a placa da incubadora, leia a absorbância da placa a 540 nanômetros. Siga os passos descritos no texto para calcular as taxas lipolíticas nos respectivos valores de R quadrado.
Em seguida, usando as taxas de produção de AGL e glicerol para cada amostra como um ponto de dados individual, execute a análise estatística e plote os valores se diferentes taxas lipolíticas estiverem sendo comparadas. Se comparar as taxas lipolíticas ex vivo entre genótipos, utilizar duas ou três amostras por animal como réplicas técnicas e utilizar a média de um ponto de dados por animal, de modo a que o tamanho da amostra seja igual ao número de animais. Em seguida, realize a análise estatística com os dados.
A produção de AGL e glicerol nos pré-adipócitos diferenciados in vitro foi linear durante o ensaio de quatro horas. As taxas de lipolítica estimulada foram significativamente maiores do que as taxas basais. Nas células estimuladas, a razão molar AGL/glicerol foi de cerca de três, indicando lipólise de triglicérides sem recaptação ou retenção significativas.
Nas células não estimuladas, a proporção foi de cerca de um, sugerindo uma fonte não lipolítica de glicerol. Em culturas ex vivo, pedaços maiores de tecido com menor relação área superficial/volume exibiram maior retenção de AGL, resultando em menores razões molares de AGL para glicerol. Nos pedaços de tecido de 25 miligramas, a retenção de AGL impactou negativamente as taxas de lipólise.
Pedaços de tecido muito minúsculos também exibiram taxas lipolíticas reduzidas. A redução da BSA no meio reduziu significativamente a liberação de AGL e glicerol. O acúmulo de AGL no meio de ASC a 5% após 24 horas de estimulação foi de cinco milimolares, enquanto o de meio de ASC a 0,5% foi de apenas 0,6 milimolar.
Os níveis de AGL nos meios coletados atingiram a zona de perigo de 2,3 milimolares em três horas. A ausência de aumento dos AGL médios e do glicerol em quatro horas sugeriu inibição do feedback. A exclusão do ponto de tempo de quatro horas causou um pequeno, mas significativo aumento nas taxas de lançamento.
A taxa de liberação de AGL foi linear mesmo entre os momentos usuais. Ao remover o meio das amostras de lipólise ex vivo, é importante garantir que os pedaços de tecido não sejam removidos acidentalmente pela pipeta. Pode ser necessário medir o conteúdo de proteínas ou lipídios nessas amostras para normalizar adequadamente os resultados.
