פרוטוקול זה מפרט את קביעת שיעור הליפוליזה של אדיפוציט בתרבית או ברקמת שומן ex vivo, ומאפשר השוואה של שיעורים ליפוליטיים בין מודלים או טיפולים של מורין. פרוטוקול זה משתמש בדגימה סדרתית, המאפשרת לאמת פנימית שליפוליזה נמדדת בפאזה ליניארית ומפחיתה את טעות המדידה. עם אופטימיזציה, פרוטוקול זה עשוי לשמש למדידת ליפוליזה ברקמת שומן חומה, רקמת שומן מאורגניזמים אחרים, או קווי תאים אדיפוגניים.
רקמות Ex vivo חייבות להיות קצוצות לגושים קטנים בגודל ובצורה עקביים כדי לאפשר קיבוע של חומצות השומן החופשיות ששוחררו על ידי BSA בתקשורת. כדי להתחיל, להכין את המדיום 5% BSA על ידי המסת חמישה גרם של אלבומין בסרום בקר, או BSA, ב 100 מיליליטר של Dulbecco's Modified Eagle's Medium, או DMEM, ללא פנול אדום. ערבבו בעדינות את התמיסה כדי להמיס את ה-BSA.
לאחר מכן הכינו ריכוזי עבודה של אמצעי בקרה וגירוי. לפני השימוש, לחמם את התקשורת ל 37 מעלות צלזיוס. תייגו צלחת של 96 בארות לאיסוף מדיה.
בתוך מכסה אדים סטרילי, בצע בידוד והתמיינות של 100% preadipocytes ראשוניים confluent. כל יומיים-שלושה, החליפו את תרבית האינסולין המכילה אינסולין תוך שמירה על נפח של מיליליטר אחד לכל באר. במחקר זה, השתמש רק בתרבויות בעלות שיעורי התמיינות מעל 90% ודומים בין קבוצות.
לאחר מכן תרבית את התאים במדיה נטולת אינסולין במשך 24 שעות לפני מדידת ליפוליזה. שטפו את התאים עם DPBS פעם אחת כדי להסיר שאריות סרום מתרבית. מכינים צלחת של 48 בארות עם באר אחת לכל שכפול.
הכניסו 400 מיקרוליטר DMEM בטמפרטורת החדר לכל באר לשימוש. השתמש בשתיים עד ארבע בקרות ובשתיים עד ארבע בארות מגורות לכל רקמה לכל עכבר. הכינו צלחת בת שש בארות עם באר אחת לכל רקמה שתיאסף מכל עכבר והניחו ארבעה מיליליטר DMEM בטמפרטורת החדר בכל באר לשימוש.
מניחים את רקמת השומן גונדל שנאספה לתוך צלחת שש בארות. מוציאים רקמה מהבאר. הניחו אותו על משטח סיליקון וחתכו אותו לחמישה עד שבעה מיליגרם גושים בעזרת מספריים.
כתם את הרקמות על מגבת נקייה כדי להסיר כל מדיה. לאחר מכן שוקלים 25 עד 30 מיליגרם, שווה ערך לחמישה או שישה גושי רקמות, עבור כל בדיקה היטב ומניחים אותם בצלחת הבדיקה 48 בארות שהוכנה בעבר. שקול את סירת המשקולות לאחר הסרת הרקמות ורשום את המשקל של כל השאריות שנותרו מאחור.
נקו את סירת המשקולות בין הדגימות וקרעו מחדש במידת הצורך. השתמש בסירת משקל חדשה עבור כל רקמה. לאחר שקילת כל דגימות הרקמה, הניחו את צלחת הבדיקה בת 48 הבארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 10% פחמן דו חמצני למשך 15 דקות.
בצע איסוף מדיה במכסה אדים סטרילי. בזמן אפס, לאחר הסרת המדיה, מוסיפים 400 מיקרוליטר של אמצעי בקרה או גירוי לכל באר ומניחים את צלחת הבדיקה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני. עבור תרבית רקמות ex vivo, יש להסיר בזהירות מדיה באמצעות פיפטה ולהימנע מריחת יניקה.
לפעמים שעה, שתיים, שלוש וארבע שעות, אוספים 200 מיקרוליטר מדיה, מחליפים אותה ב-200 מיקרוליטר של אמצעי הבקרה או הגירוי המתאימים, ומחזירים את צלחת הבדיקה לאינקובטור. אחסנו את צלחת האיסוף בארבע מעלות צלזיוס. מפשירים ומערבבים את הדגימות.
חממו את הריאגנטים לטמפרטורת החדר והמיסו בקבוק אחד של מגיב צבע A באמצעות בקבוק אחד של ממס A ובקבוק אחד של מגיב צבע B באמצעות בקבוק אחד של ממס B.לאחר יצירת עקומת חומצת שומן חופשית או עקומת תקן FFA, תקני פיפטה ודגימות לצלחת בדיקה של 96 בארות. נפח הדגימה המומלץ הוא 10 מיקרוליטר לבאר. מוסיפים 150 מיקרוליטר מגיב A לכל באר ומערבבים.
לדגור על צלחת הבדיקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. קראו את ספיגת הצלחת ב-550 ננומטר ו-660 ננומטר וקראו לזה קריאה A.הוסיפו 75 מיקרוליטר מגיב B לכל באר וערבבו. לדגור על צלחת הבדיקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן לאחר הסרת הצלחת מהאינקובטור, קרא שוב את ספיגת הצלחת ב 550 ו 660 ננומטר. עיין בקריאה זו כקריאה B.Rebuild מגיב גליצרול חופשי עם 36 ליטר מים טהורים במיוחד והתאקלם אותו לטמפרטורת החדר. מפשירים ומערבבים את הדגימות.
צור עקומה סטנדרטית של גליצרול על ידי ביצוע דילול סדרתי פי 7.2 של תמיסת הגליצרול הסטנדרטית וריק במים. פיפטה 25 מיקרוליטר של כל תקן ודגימות, לתוך צלחת הבדיקה 96-well. מוסיפים 175 מיקרוליטר של מגיב גליצרול חופשי לכל באר ומערבבים.
לדגור על צלחת הבדיקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הוצאת הצלחת מהאינקובטור, יש לקרוא את ספיגת הצלחת ב-540 ננומטר. בצע את השלבים המתוארים בטקסט כדי לחשב את השיעורים הליפוליטיים בערכי הריבוע R המתאימים.
לאחר מכן השתמש בקצבי הייצור של FFA וגליצרול עבור כל דגימה כנקודת נתונים בודדת, בצע ניתוח סטטיסטי והתווה את הערכים אם משווים שיעורים ליפוליטיים שונים. אם אתם משווים שיעורים ליפוליטיים של ex vivo בין גנוטיפים, השתמשו בשתיים או שלוש דגימות לכל חיה כשכפולים טכניים והשתמשו בממוצע עבור נקודת נתונים אחת לכל בעל חיים, כך שגודל המדגם יהיה שווה למספר בעלי החיים. לאחר מכן בצע ניתוח סטטיסטי עם הנתונים.
ייצור FFA וגליצרול במבחנה היה ליניארי במהלך הניסוי בן ארבע השעות. שיעורי הליפוליטיקה המגורה היו גבוהים משמעותית מהשיעורים הבסיסיים. בתאים מגורים, היחס המולרי FFA-לגליצרול היה בערך שלושה, מה שמצביע על ליפוליזה של טריגליצרידים ללא ספיגה חוזרת או שימור משמעותיים.
בתאים הלא מגורים, היחס היה בערך אחד, מה שמרמז על מקור לא ליפוליטי של גליצרול. בתרביות ex vivo, גושי רקמה גדולים יותר בעלי יחס שטח פנים לנפח נמוך יותר הציגו שימור FFA גבוה יותר, וכתוצאה מכך יחסים מולאריים FFA-לגליצרול נמוכים יותר. בגושי רקמה של 25 מיליגרם, שימור FFA השפיע לרעה על שיעורי הליפוליזה.
גושי רקמה זעירים מאוד הציגו גם שיעורים ליפוליטיים מופחתים. הפחתת BSA בתקשורת הפחיתה באופן משמעותי הן FFA והן שחרור גליצרול. הצטברות ה-FFA במדיה של 5% BSA לאחר גירוי של 24 שעות הייתה חמישה מילימולרית בעוד זו של מדיה של 0.5% BSA הייתה רק 0.6 מילימולר.
רמות ה-FFA במדיה שנאספה הגיעו לאזור הסכנה של 2.3 מילימולר תוך שלוש שעות. היעדר עלייה במדיה FFA וגליצרול לאחר ארבע שעות הצביע על עיכוב משוב. אי הכללת נקודת הזמן של ארבע שעות גרמה לעלייה קטנה, אך משמעותית, בשיעורי השחרור.
קצב שחרור ה-FFA היה ליניארי אפילו בין נקודות הזמן הרגילות. בעת הסרת מדיה מדגימות הליפוליזה ex vivo, חשוב לוודא שגושי הרקמה אינם מוסרים בטעות על ידי הפיפטה. ייתכן שיהיה צורך למדוד את תכולת החלבון או השומנים בדגימות אלה כדי לנרמל כראוי את התוצאות.
