Ce protocole détaille la détermination du taux de lipolyse adipocytaire dans les adipocytes en culture ou le tissu adipeux ex vivo, permettant de comparer les taux lipolytiques entre modèles murins ou traitements. Ce protocole utilise l’échantillonnage en série, ce qui permet de valider en interne que la lipolyse est mesurée dans la phase linéaire et réduit l’erreur de mesure. Avec optimisation, ce protocole peut être utilisé pour mesurer la lipolyse dans le tissu adipeux brun, le tissu adipeux d’autres organismes ou les lignées cellulaires adipogènes.
Les tissus ex vivo doivent être coupés en petits morceaux de taille et de forme constantes pour permettre la séquestration des acides gras libres libérés par le BSA dans le milieu. Pour commencer, préparez le milieu BSA à 5% en dissolvant cinq grammes d’albumine sérique bovine, ou BSA, dans 100 millilitres de milieu d’aigle modifié de Dulbecco, ou DMEM, sans rouge de phénol. Remuer doucement la solution pour dissoudre le BSA.
Préparez ensuite les concentrations de travail des milieux de contrôle et de stimulation. Avant utilisation, réchauffez le média à 37 degrés Celsius. Étiquetez une plaque de 96 puits pour la collecte des médias.
À l’intérieur d’une hotte stérile, isoler et différencier les préadipocytes primaires confluents à 100%. Tous les deux à trois jours, changer les milieux de culture contenant de l’insuline en maintenant un volume d’un millilitre par puits. Pour cette étude, n’utilisez que des cultures ayant des taux de différenciation supérieurs à 90 % et similaires d’un groupe à l’autre.
Ensuite, cultivez les cellules dans un milieu exempt d’insuline pendant 24 heures avant de mesurer la lipolyse. Lavez les cellules avec DPBS une fois pour éliminer le sérum résiduel du milieu de culture. Préparez une plaque de 48 puits avec un puits pour chaque répétition.
Placez 400 microlitres de DMEM à température ambiante dans chaque puits à utiliser. Utilisez deux à quatre puits témoins et deux à quatre puits stimulés par tissu et par souris. Préparez une plaque de six puits avec un puits pour chaque tissu à prélever sur chaque souris et mettez quatre millilitres de DMEM à température ambiante dans chaque puits à utiliser.
Placez le tissu adipeux gonadique recueilli dans la plaque à six puits. Retirez les tissus du puits. Placez-le sur un tapis de silicone et coupez-le en morceaux de cinq à sept milligrammes avec des ciseaux.
Épongez les mouchoirs sur une serviette propre pour enlever tout support. Pesez ensuite de 25 à 30 milligrammes, soit l’équivalent de cinq ou six morceaux de tissu, pour chaque puits de dosage et placez-les dans la plaque de dosage de 48 puits préparée précédemment. Pesez le bateau de poids après avoir retiré les mouchoirs et notez le poids de tout résidu laissé derrière.
Essuyez le bateau de musculation entre les échantillons et redéchirez si nécessaire. Utilisez un nouveau bateau de musculation pour chaque tissu. Une fois que tous les échantillons de tissus ont été pesés, placez la plaque de dosage à 48 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 10% de dioxyde de carbone pendant 15 minutes.
Effectuer la collecte des supports dans une hotte stérile. Au temps zéro, après avoir retiré le média, ajoutez 400 microlitres de milieu témoin ou de stimulation par puits et placez la plaque d’essai dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 10% de dioxyde de carbone. Pour la culture tissulaire ex vivo, retirez soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette et évitez d’appliquer l’aspiration.
Parfois, une, deux, trois et quatre heures, collectez 200 microlitres de média, remplacez-les par 200 microlitres du milieu de contrôle ou de stimulation approprié et remettez la plaque d’essai dans l’incubateur. Conservez la plaque de collecte à quatre degrés Celsius. Décongeler et mélanger les échantillons.
Réchauffer les réactifs à température ambiante et dissoudre un flacon de réactif de couleur A à l’aide d’un flacon de solvant A et un flacon de réactif de couleur B à l’aide d’un flacon de solvant B.Après avoir créé une courbe standard d’acide gras libre ou FFA, pipeter les étalons et les échantillons dans une plaque d’essai à 96 puits. Le volume d’échantillon recommandé est de 10 microlitres par puits. Ajouter 150 microlitres de réactif A à chaque puits et mélanger.
Incuber la plaque d’essai à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Lisez l’absorbance de la plaque à 550 nanomètres et 660 nanomètres et appelez-la A.Ajoutez 75 microlitres de réactif B à chaque puits et mélangez. Incuber la plaque d’essai à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, après avoir retiré la plaque de l’incubateur, lisez à nouveau l’absorbance de la plaque à 550 et 660 nanomètres. Reconstituer le réactif glycérol libre avec 36 litres d’eau ultrapure et l’acclimater à température ambiante. Décongeler et mélanger les échantillons.
Créer une courbe étalon glycérol en faisant une dilution en série de 7,2 fois de la solution étalon de glycérol et d’un blanc d’eau. Pipeter 25 microlitres de chaque étalon et des échantillons dans la plaque d’essai à 96 puits. Ajouter 175 microlitres de réactif glycérol libre à chaque puits et mélanger.
Incuber la plaque d’essai à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, lisez l’absorbance de la plaque à 540 nanomètres. Suivez les étapes décrites dans le texte pour calculer les taux lipolytiques dans les valeurs R carrés respectives.
Ensuite, en utilisant les taux de production de FFA et de glycérol pour chaque échantillon comme point de données individuel, effectuez une analyse statistique et tracez les valeurs si différents taux lipolytiques sont comparés. Si vous comparez les taux lipolytiques ex vivo entre les génotypes, utiliser deux ou trois échantillons par animal comme réplications techniques et utiliser la moyenne d’un point de données par animal afin que la taille de l’échantillon soit égale au nombre d’animaux. Effectuez ensuite une analyse statistique avec les données.
La production de FFA et de glycérol dans les préadipocytes différenciés in vitro était linéaire pendant le test de quatre heures. Les taux lipolytiques stimulés étaient significativement plus élevés que les taux basaux. Dans les cellules stimulées, le rapport molaire FFA-glycérol était d’environ trois, indiquant une lipolyse des triglycérides sans recapture ou rétention significative.
Dans les cellules non stimulées, le rapport était d’environ un, suggérant une source non lipolytique de glycérol. Dans les cultures ex vivo, les plus gros morceaux de tissu ayant un rapport surface/volume plus faible présentaient une rétention plus élevée des AGL, ce qui entraînait des rapports molaires FFA-glycérol plus faibles. Dans les morceaux de tissu de 25 milligrammes, la rétention d’AGL a eu un impact négatif sur les taux de lipolyse.
De très petits morceaux de tissus présentaient également des taux lipolytiques réduits. La réduction de la BSA dans le milieu a significativement réduit à la fois la libération de FFA et de glycérol. L’accumulation de FFA dans le milieu BSA à 5 % après stimulation de 24 heures était de cinq millimolaires alors que celle du milieu BSA à 0,5 % n’était que de 0,6 millimolaire.
Les niveaux de FFA dans les milieux collectés ont atteint la zone de danger de 2,3 millimolaires en trois heures. L’absence d’augmentation de l’AGL et du glycérol dans les milieux à quatre heures suggère une inhibition de la rétroaction. L’exclusion du délai de quatre heures a entraîné une augmentation faible, mais significative, des taux de libération.
Le taux de libération de FFA était linéaire même entre les points temporels habituels. Lors du retrait du milieu des échantillons de lipolyse ex vivo, il est important de s’assurer que les morceaux de tissu ne sont pas accidentellement enlevés par la pipette. Il peut être nécessaire de mesurer la teneur en protéines ou en lipides de ces échantillons pour normaliser correctement les résultats.
