通过 CLON-G 和 体外 自发死亡测定延长中性粒细胞寿命

我们的方案提供了一种鸡尾酒培养基，可将中性粒细胞的寿命延长至五天以上，而不会影响中性粒细胞的功能。它还为中性粒细胞提供可靠的体外透析。CLON-G治疗扩大了中性粒细胞保存、运输和基因操作的可能性，可以加速中性粒细胞群落的研究。

首先，通过将RPMI 1640 FBS和笔链球菌添加到50毫升管中来制备碱性培养基。同时，在冰上解冻CLON-G组分的所有储备溶液。然后在碱性培养基中稀释HSP 70和每毫升200微克G-CSF。

将976微升碱性培养基转移到15毫升离心管中。为此，加入 CLON-G 组分以制备一毫升 2x CLON-G 培养基，如手稿中所述。接下来，通过将分离的小鼠中性粒细胞悬浮在碱性培养基中来制备中性粒细胞培养物。

加入CLON-G培养基，然后将碱性培养基加入24孔非组织培养板中。然后加入100微升准备好的细胞悬液，轻轻移液三到四次。将培养板在37摄氏度下与5%二氧化碳供应一起孵育。

用细胞旋转物对培养的中性粒细胞进行染色，并使用光学显微镜进行分析。对于流式细胞术分析，将一毫升细胞培养基添加到过夜生长的中性粒细胞培养物中。通过轻轻移液五到七次来混合细胞培养基，并在所需的时间点将该混合物转移到流式细胞术管中。

同时，涡旋计数珠并将10微升磁珠溶液移液到含有细胞培养基的同一流式细胞术管中。向该流式细胞术管中加入10微升预先制备的染色混合物，并在冰箱中避光孵育五分钟。然后在管中加入100微升盐水并充分混合，以使计数珠和细胞均匀分布。

最后，按照文本手稿中的说明对细胞悬液进行流式细胞术分析。对于荧光图像测定，每个共聚焦板加入两毫升细胞悬液，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。同时，将一克氯化钙溶解在45毫升盐水中，并用0.2微米过滤单元过滤。

在所需的时间点轻轻取下共聚焦板。在室温下用10微升FITC-膜联蛋白-V，PI和氯化钙染色细胞五分钟。然后使用共聚焦荧光显微镜，使用所需的通道捕获图像。

在本研究中，即使在五天后，CLON-G培养基中中性粒细胞的形态也没有受到影响。此外，传真表型在处理后显示出完整的细胞。流式细胞术分析显示膜联蛋白-V中未经处理的中性粒细胞群呈阳性，细胞群损失可能是由于细胞培养基中的乙二胺四乙酸所致。

然而，CLON-G处理的中性粒细胞在24小时内的活力约为90%以上荧光图像测定也证实了CLON-G处理的中性粒细胞的细胞活力。在碱性培养基中培养24小时的中性粒细胞显示膨化细胞，这些细胞的丢失可能是由于共聚焦板的摇晃或移液引起的。CLON-G化合物浓度和效应可显著影响中性粒细胞试验。

如果可能的话，避免调制它们。中性粒细胞研究费力、昂贵，并且由于其寿命短而在临床应用中极为有限。这种方法部分克服了这些障碍。