人瘢痕疙瘩组织中原代真皮成纤维细胞的分离、培养和表征

来自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞的分离和培养是进一步研究瘢痕疙瘩的基础。通过该协议可以轻松获得来自瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞，这可以为瘢痕疙瘩研究提供实验室中丰富而稳定的细胞来源。首先使用无菌镊子将瘢痕疙瘩组织放入含有10至25毫升补充有1%PSA的PBS的50毫升无菌离心管中。

同时，向六孔板的每个孔中加入四毫升PBS PSA溶液。现在将纸巾从管中取出，并用PBS PSA溶液洗涤两次。使用一对无菌镊子，将组织从一个孔依次转移到下一个孔。

然后用手术剪刀去除脂肪和表皮层，保持真皮不变。用一把剪刀将修剪过的真皮解剖成三到五平方毫米的碎片，然后用一对无菌镊子将碎片转移到下一个孔中。在PBS PSA溶液中清洗碎片。

使用无菌镊子，将10至30个相距小于5毫米的真皮组织碎片放置在培养皿中。将盘子倒置放入培养箱中，直到块变干并粘在盘子上。接下来，加入7毫升补充有10%FBS和1%PSA的DMEM，并像以前一样孵育培养皿。

三天后，用完全培养基替换一半的上清液。每天在40X显微镜下观察成纤维细胞。当成纤维细胞达到90%汇合度时，去除培养基中的组织碎片。

在PBS中洗涤成纤维细胞，并加入两毫升无菌胰蛋白酶EDTA溶液。在加湿的培养箱中孵育细胞后，轻轻敲击培养皿并在显微镜下观察。加入两毫升完全培养基，一旦大多数细胞分离，即可结束消化。

现在将细胞悬液转移到15毫升无菌离心管中，并在室温下以300G离心管三分钟。小心丢弃上清液并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。将成纤维细胞接种到9厘米的细胞培养皿中，并在加湿的培养箱中孵育。

要在圆形盖玻片上培养成纤维细胞并将其在一抗和二抗中孵育后进行免疫荧光分析，向载玻片中加入 50 微升 DAPI 溶液以染色细胞核。用镊子将洗好的盖玻片放在载玻片上。最后，将样品转移到湿暗盒中进行荧光显微镜检查。

在处理后五天观察到组织的成纤维细胞生长。成纤维细胞表现出高增殖速率，并在10天后达到汇合。成纤维细胞具有细长的纺锤状细胞体，它们在高汇合度下排列成束。

免疫荧光染色显示成纤维细胞的红色免疫荧光呈阳性，细胞核的蓝色免疫荧光呈阳性。流式细胞术测定显示几乎所有成纤维细胞的CD90阳性。这项研究描述了一种优化的方法，并提供了明确的说明，以解决现有的挑战，并增加瘢痕疙瘩成纤维细胞分离和培养的成功机会。