拟 南芥 花粉管接收和半体外隔膜法 双受精的实时成像

该方法将通过允许以高效率和每次成像的高样本量数量观察配子体相互作用来促进拟南芥有性生殖的研究。该技术的主要优点是通过将胚珠保持在隔膜上，胚珠的数量和接受性比以前的方法大大增加。解剖技术最初可能很困难，需要稳定的手。

因此，建议在开始实验之前在阉割的雌蕊上练习几次。首先按照文中的说明制备花粉萌发培养基。琼脂完全融化后，将130微升培养基移液到35毫米玻璃底培养皿的14毫米孔中。

旋转培养皿，直到培养基覆盖孔。使用移液管从培养皿中心吸出 40 微升培养基，留下 90 微升培养基。为确保培养基均匀冷却，请将培养皿在湿度室的铝块上冷却，然后将板在 4 摄氏度下存放过夜。

在成像前的早晨，选择健康的拟南芥植物，这些植物最近开始作为隔膜供体和柱头供体产生。在阉割三期 12B 隔膜供体花和 12 期 12B 柱头供体花之前，去除花序上的老花，去除它们的雄蕊、萼片和花瓣。24小时后的早晨，用容易脱落花粉的花粉供体花朵为柱头供体授粉。

当柱头几乎完全被花粉覆盖时，授粉完成。授粉后 30 分钟，取出蒂处健康成熟的隔膜供体雌蕊，并将其放入安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带中，柱头刚好贴在胶带边缘。使用新的胰岛素注射器针头的背面轻轻按压椎弓根和沿卵巢，将雌蕊牢固地固定在胶带上。

去除阉割时残留的萼片、花瓣和雄蕊碎片。在立体镜下，使用胰岛素注射器针头在样式-卵巢连接处和卵巢-蒂连接处对每个心皮进行两次切口。然后沿着每个心皮的隔膜进行浅切口，并将卵巢壁剥离到胶带上，露出胚珠。

在两个隔膜之间轻轻滑动针头，沿雌蕊的整个长度切割梅花，而不会干扰胚珠。然后在样式附近切割顶部隔膜，使整个隔膜抬起。接下来，使用镊子从椎弓根上取下隔膜。

将隔膜尽可能平放在培养基上，胚珠的微绒面朝上。然后轻轻按压隔膜，直到胚珠略微嵌入培养基中。将授粉的柱头供体雌蕊放在安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带上，使卵巢式连接脱离胶带边缘。

使用剃须刀片将款式直接向下切割，然后用刀片上的柱头将其抬起。用胰岛素注射器针头从刀片上去除柱头，并将其平放在距离胚珠约250至300微米处。转移多达 12 个柱头，在每个隔膜的两侧放置两个柱头。

在显微镜上的湿度室中孵育后，在21摄氏度下保持92%相对湿度，培养皿即可成像。在低光强度的明场下聚焦样品，然后切换到荧光灯。接下来，在要成像的载物台概览上标记样品的区域。

完成后，使用多级采集方案开始成像，在每个概览区域的开头具有自动对焦功能。孵育后大约七到九小时，检查花粉管是否被胚珠吸引并被胚珠接收。成功的花粉管接收显示胚珠微堆中的花粉管爆炸性爆发。

完成后，停止收购。对半体外切除胚珠法进行了8次技术重复，并对成功接受花粉管进行了评分。绿色方块表示接收成功，红色方块表示接收有缺陷。

这些实验表明，大约28%的胚珠显示爆炸性花粉管破裂，导致效率从大约10%到50%使用半体外暨隔膜方法，能够对更多的啤酒胚珠进行评分，并且在一次成像会话中记录了多达40个成功接收花粉管的实例，如在带有绿色方块的胚珠中看到的那样。该方法的五个技术重复表明，大约79%的吸引花粉管的胚珠表现出爆炸性花粉管破裂，导致效率从大约70%到100%在花粉管破裂时，观察到感受协同的细胞核同时降解，分辨率为一分钟。核瑜伽术后，观察到卵细胞核向微堆的迁移。

左协同和右协同都能够作为接受协同作用。这种方法成功的关键因素是分期、使用新鲜制备的培养基、将胚珠嵌入培养基中、保持高湿度并确保低光毒性。还可以将这种技术与双光子激发成像相结合，以更仔细地观察配子体相互作用期间发生的生理和细胞学变化。

人们也可以通过固定胚珠将其与电子显微镜相结合。