Этот метод облегчит исследования полового размножения у арабидопсиса, позволяя наблюдать взаимодействия гаметофитов с высокой эффективностью и с большим числом выборки за сеанс визуализации. Основным преимуществом этого метода является удержание яйцеклеток на перегородке, количество и восприимчивость яйцеклеток значительно увеличивается по сравнению с предыдущими методами. Техника вскрытия поначалу может быть сложной и требует твердой руки.
Поэтому рекомендуется несколько раз потренироваться на выхолощенных пестиках, прежде чем приступать к эксперименту. Начните с подготовки среды для прорастания пыльцы, как описано в тексте. После того, как агар полностью расплавится, налейте пипеткой 130 микролитров среды в 14-миллиметровую лунку 35-миллиметровой чашки со стеклянным дном.
Вращайте блюдо, пока среда не покроет лунку. Отдохните 40 микролитров среды от центра посуды с помощью пипетки, оставив после себя 90 микролитров среды. Чтобы обеспечить равномерное охлаждение среды, охладите блюдо на алюминиевом блоке во влажной камере, прежде чем хранить тарелки при четырех градусах Цельсия на ночь.
Утром перед визуализацией выберите здоровые растения арабидопсиса, которые недавно начали производиться в качестве доноров перегородки и доноров стигмы. Удалите старые цветы на соцветии, прежде чем выхолостить трехступенчатые цветы-доноры перегородки 12B и цветы-доноры 12-го этапа 12B, удалив их тычинки, чашелистики и лепестки. Утром через 24 часа опыляйте доноров рыльца цветами-донорами пыльцы, которые легко сбрасывают пыльцу.
Опыление завершается, когда рыльца почти полностью покрыты пыльцой. Через 30 минут после опыления удалите здоровый и зрелый пестик-донор перегородки на ножке и поместите его в свежую двустороннюю липкую ленту, установленную на предметном стекле так, чтобы рыльце торчало прямо с края ленты. Надежно прижмите пестик к ленте, осторожно надавливая на ножку и вдоль яичника с помощью обратной стороны новой иглы инсулинового шприца.
Удалите чашелистик, лепесток и остатки тычинок, оставшиеся от выхолащивания. Под стереоскопом используйте иглу инсулинового шприца, чтобы сделать два надреза на плодолистик на стыке стиля и яичника и ножки. Затем сделайте неглубокие надрезы вдоль перегородки каждого плодолистика и отклейте стенки завязи на ленту, обнажив семязачатки.
Осторожно проведите иглу между двумя перегородками, чтобы разрезать реплюм по всей длине пестика, не нарушая семязачатки. Затем разрежьте верхнюю перегородку рядом со стилем, чтобы вся перегородка оторвалась. Далее удаляют перегородку с ножки с помощью щипцов.
Поместите перегородку как можно более ровно на среду микроспитками семяпочек вверх. Затем аккуратно прижмите перегородку до тех пор, пока семяпочки слегка не встроятся в среду. Поместите опыляемые пестики-доноры рыльца на свежую двустороннюю липкую ленту, установленную на стеклянном предметном стекле так, чтобы соединение в виде яичника было за пределами края ленты.
Срежьте стиль прямо вниз с помощью лезвия бритвы и снимите его с рыльцем, прикрепленным к лезвию. Удалите рыльце с лезвия с помощью иглы инсулинового шприца и поместите его на расстоянии примерно от 250 до 300 микрометров от семяпочек. Перенесите до 12 рыльцев, разместив по два с каждой стороны от каждой перегородки.
После инкубации в камере влажности на микроскопе, поддерживаемой на уровне относительной влажности 92% при температуре 21 градус Цельсия, чашка готова к визуализации. Сфокусируйте образцы в ярком поле при низкой интенсивности света, затем переключитесь на флуоресцентный свет. Затем отметьте области образца в обзоре рабочей области, которые необходимо визуализировать.
После этого начните съемку, используя многоступенчатую схему сбора данных с функцией автофокусировки в начале каждой области обзора. Примерно через семь-девять часов после инкубации проверьте, были ли пыльцевые трубки привлечены и получены яйцеклетками. Успешный прием пыльцевой трубки показывает взрывной взрыв пыльцевой трубки в микрокуче семяпочек.
Когда закончите, остановите приобретение. Было проведено восемь технических повторений метода удаления семяпочек полуin vitro, которые были оценены для успешного приема пыльцевой трубки. Зеленые квадраты показывают успешный прием, а красные квадраты показывают дефектный прием.
Эти эксперименты показали, что около 28% яйцеклеток демонстрируют взрывной разрыв пыльцевой трубки, что приводит к эффективности в диапазоне примерно от 10 до 50%.Используя метод полу-in vitro cum septum, можно было набрать гораздо больше семяпочек эля, и за один сеанс визуализации было зарегистрировано до 40 случаев успешного приема пыльцевой трубки, как видно из яйцеклеток с зелеными квадратами. Пять технических повторений этого метода показали, что примерно 79% яйцеклеток, привлекающих пыльцевые трубки, демонстрируют взрывной разрыв пыльцевой трубки, что приводит к эффективности в диапазоне примерно от 70 до 100% При разрыве пыльцевой трубки наблюдалось, что ядро рецептивного синергида разлагается одновременно с разрешением в одну минуту. После кариогамии наблюдалась миграция ядра яйцеклетки к микрокуче.
Как левый, так и правый синергиды могли служить рецептивным синергидом. Критическими факторами, на которые следует обратить внимание для успеха этого метода, являются постановка, использование свежеприготовленной среды, встраивание яйцеклеток в среду, поддержание высокой влажности и обеспечение низкой фототоксичности. Можно также соединить этот метод с двухфотонной визуализацией возбуждения для более тщательного наблюдения за физиологическими и цитологическими изменениями, которые происходят во время взаимодействия гаметофритов.
Можно также соединить это с электронной микроскопией, зафиксировав яйцеклетки.
