本手法により、シロイヌナズナの有性生殖に関する研究が可能となり、配偶体の相互作用を高効率かつ高いサンプルサイズで観察することが可能となります。この技術の主な利点は、胚珠を中隔に保持することによって、胚珠の量と受容性が以前の方法よりも大幅に増加することです。解剖技術は最初は難しい場合があり、安定した手が必要です。
したがって、実験を始める前に、去勢された雌しべで数回練習することをお勧めします。本文で説明されているように花粉発芽培地を準備することから始めます。寒天が完全に溶けた後、130マイクロリットルの培地を35ミリメートルのガラス底皿の14ミリメートルウェルにピペットで入れます。
培地が井戸を覆うまで皿を回転させます。ピペットを使用して皿の中心から40マイクロリットルの培地を吸引し、90マイクロリットルの培地を残します。培地を均一に冷却するには、プレートを摂氏4度で一晩保管する前に、湿度チャンバー内のアルミニウムブロックで皿を冷却します。
イメージングの前朝、セプタムドナーとスティグマドナーとして最近生産し始めた健康なシロイヌナズナ植物を選択してください。花序の古い花を取り除き、雄しべ、がく片、花びらを取り除いて、3段階の12Bセプタムドナー花と12段階の12B柱頭ドナー花を去勢します。24時間後の朝、花粉を簡単に落としている花粉ドナーの花で柱頭ドナーを受粉させます。
柱頭が花粉でほぼ完全に覆われると受粉は完了します。受粉の30分後、茎で健康で成熟した中隔ドナー雌しべを取り除き、テープの端から柱頭が突き刺さった状態でスライドガラスに取り付けられた新しい両面粘着テープに入れます。新しいインスリン注射針の裏側を使用して、茎をそっと押し、卵巣に沿って雌しべをテープにしっかりと固定します。
去勢から残ったがく片、花びら、雄しべの破片を取り除きます。ステレオスコープの下で、インスリン注射針を使用して、スタイル-卵巣接合部と卵巣-茎接合部で心皮ごとに2つのカットを作成します。次に、各心皮の中隔に沿って浅い切り込みを入れ、卵巣壁をテープに剥がして胚珠を露出させます。
2つのセプタムの間で針をそっとスライドさせて、胚珠を乱すことなく雌しべの全長に沿ってリプラムを切ります。次に、スタイルの近くの上部セプタムを切り取り、セプタム全体が持ち上がるようにします。次に、鉗子を使用して茎から中隔を取り除きます。
胚珠のマイクロパイルを上に向けて、セプタムを培地上にできるだけ平らに置きます。次に、胚珠が培地にわずかに埋め込まれるまで中隔を静かに押します。受粉した柱頭ドナー雌しべを、卵巣スタイルの接合部がテープの端から外れるようにスライドガラスに取り付けられた新鮮な両面粘着テープの上に置きます。
かみそりの刃を使ってスタイルをまっすぐに切り取り、刃に付けられた柱頭で持ち上げます。インスリン注射針で刃から柱頭を取り除き、胚珠から約250〜300マイクロメートルのところに平らに置きます。最大12の柱頭を移し、各セプタムの両側に2つずつ配置します。
摂氏21度で92%の相対湿度に維持された顕微鏡上の湿度チャンバーでインキュベートした後、皿はイメージングの準備ができています。低光強度の明視野下でサンプルに焦点を合わせてから、蛍光灯に切り替えます。次に、ステージの概要で画像化するサンプルの領域をマークします。
完了したら、各オーバービューエリアの開始時にオートフォーカス機能を備えた多段階取得スキームを使用してイメージングを開始します。インキュベーション後約7〜9時間で、花粉管が胚珠に引き付けられ、胚珠に受け取られたことを確認します。成功した花粉管の受信は、胚珠のマイクロパイルにおける花粉管の爆発的な破裂を示す。
完了したら、取得を停止します。半体外切除胚珠法の8つの技術的複製を実施し、花粉管受容の成功についてスコアを付けました。緑の四角形は受信の成功を示し、赤い四角は受信不良を示します。
これらの実験により、胚珠の約28%が爆発的な花粉管破裂を示し、約10〜50%の範囲の効率をもたらすことが明らかになりました半体外兼中隔法を使用すると、さらに多くのエール胚珠をスコアリングすることができ、緑色の四角形の胚珠に見られるように、1回のイメージングセッションで花粉管の受信が成功した最大40例が記録されました。この方法の5つの技術的複製は、花粉管を引き付ける胚珠の約79%が爆発的な花粉管破裂を示し、約70〜100%の範囲の効率をもたらすことを示しました花粉管が破裂すると、受容相乗作用体の核は1分間の分解能で同時に分解することが観察されました。核分裂後、卵細胞核のマイクロパイルへの移動が見られた。
左右のシナジーイドの両方が受容シナジーイドとして機能することができた。この方法を成功させるために注意すべき重要な要素は、病期分類、新たに調製した培地の使用、培地への胚珠の埋め込み、高湿度の維持、および低光毒性の確保です。また、この手法を2光子励起イメージングと組み合わせて、配偶体の相互作用中に発生する生理学的および細胞学的変化をより詳細に観察することもできます。
胚珠を固定することで、これを電子顕微鏡と結合することもできます。
