Questo metodo faciliterà la ricerca sulla riproduzione sessuale in Arabidopsis consentendo l'osservazione delle interazioni dei gametofiti con alta efficienza e con un elevato numero di campioni per sessione di imaging. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mantenendo gli ovuli sul setto, la quantità e la ricettività degli ovuli è notevolmente aumentata rispetto ai metodi precedenti. La tecnica di dissezione può inizialmente essere difficile e richiede una mano ferma.
Pertanto, si consiglia di esercitarsi alcune volte su pistilli evirati prima di iniziare con l'esperimento. Inizia preparando il mezzo di germinazione del polline come spiegato nel testo. Dopo che l'agar è completamente fuso, pipettare 130 microlitri del mezzo nel pozzetto da 14 millimetri di un piatto di fondo di vetro da 35 millimetri.
Ruotare il piatto fino a quando il mezzo copre il pozzo. Aspirare 40 microlitri di mezzo dal centro del piatto usando una pipetta, lasciando dietro di sé 90 microlitri di mezzo. Per garantire un raffreddamento uniforme del mezzo, raffreddare il piatto su un blocco di alluminio in una camera di umidità prima di conservare le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte.
La mattina prima dell'imaging, scegli piante di Arabidopsis sane che hanno recentemente iniziato a produrre come donatori di setto e donatori di stigma. Rimuovere i fiori più vecchi sull'infiorescenza prima di evirare i fiori donatori di setto 12B a tre stadi e i fiori donatori di stigma 12B a 12 stadi rimuovendo i loro stami, sepali e petali. Al mattino 24 ore dopo, impollinare i donatori di stigma con i fiori del donatore di polline che stanno prontamente spargendo polline.
L'impollinazione è completa quando gli stimmi sono quasi completamente ricoperti di polline. 30 minuti dopo l'impollinazione, rimuovere un pistillo donatore di setto sano e maturo sul peduncolo e metterlo in nastro adesivo biadesivo fresco montato su un vetrino con lo stigma che si attacca appena fuori dal bordo del nastro. Fissare saldamente il pistillo sul nastro premendo delicatamente sul peduncolo e lungo l'ovaio usando il retro di un nuovo ago da siringa da insulina.
Rimuovere i detriti di sepalo, petalo e stame rimasti dall'evirazione. Sotto uno stereoscopio, utilizzare un ago da siringa da insulina per effettuare due tagli per carpello alla giunzione stile-ovaio e alla giunzione ovaio-peduncolo. Quindi effettuare tagli superficiali lungo il setto di ciascun carpello e staccare le pareti dell'ovaio sul nastro, esponendo gli ovuli.
Far scorrere delicatamente l'ago tra i due setti per tagliare il replum lungo tutta la lunghezza del pistillo senza disturbare gli ovuli. Quindi tagliare il setto superiore vicino allo stilo in modo che l'intero setto si sollevi via. Quindi, rimuovere il setto dal peduncolo usando una pinza.
Posizionare il setto il più piatto possibile sul mezzo con le micropile degli ovuli rivolte verso l'alto. Quindi premere delicatamente il setto fino a quando gli ovuli sono leggermente incorporati nel mezzo. Posizionare i pistilli del donatore di stigma impollinato su nastro adesivo fresco e biadesivo montato su un vetrino in modo tale che la giunzione in stile ovaio sia fuori dal bordo del nastro.
Taglia lo stilo verso il basso usando una lametta e sollevalo via con lo stigma attaccato alla lama. Rimuovere lo stigma dalla lama con un ago da siringa da insulina e posizionarlo piatto a circa 250-300 micrometri dagli ovuli. Trasferisci fino a 12 stigmi, posizionandone due su entrambi i lati di ciascun setto.
Dopo l'incubazione in una camera di umidità sul microscopio mantenuta al 92% di umidità relativa a 21 gradi Celsius, il piatto è pronto per l'imaging. Mettere a fuoco i campioni in campo chiaro a bassa intensità luminosa, quindi passare alla luce fluorescente. Quindi, contrassegnare le aree del campione sulla panoramica dello stage da visualizzare.
Una volta fatto, inizia a scattare immagini utilizzando uno schema di acquisizione multistadio con una funzione di messa a fuoco automatica all'inizio di ogni area panoramica. Circa sette-nove ore dopo l'incubazione, controllare che i tubi pollinici siano stati attratti e ricevuti dagli ovuli. Il successo della ricezione del tubo pollinico mostra un'esplosione esplosiva del tubo pollinico nella micropila degli ovuli.
Al termine, interrompere l'acquisizione. Sono state condotte otto repliche tecniche del metodo degli ovuli asportati semi in vitro e valutate per il successo della ricezione del tubo pollinico. I quadrati verdi mostrano una ricezione riuscita e i quadrati rossi mostrano una ricezione difettosa.
Questi esperimenti hanno rivelato che circa il 28% degli ovuli mostra lo scoppio esplosivo del tubo pollinico, con un'efficienza che varia da circa il 10 al 50% Utilizzando il metodo semi in vitro con setto, molti più ovuli di ales sono stati in grado di essere valutati e fino a 40 casi di ricezione del tubo pollinico di successo sono stati registrati in una sessione di imaging come visto negli ovuli con quadrati verdi. Cinque repliche tecniche di questo metodo hanno mostrato che circa il 79% degli ovuli che attirano i tubi pollinici mostrano uno scoppio esplosivo del tubo pollinico, con conseguente efficienza che varia da circa il 70 al 100% Alla rottura del tubo pollinico, il nucleo del sinergico ricettivo è stato osservato degradarsi allo stesso tempo con una risoluzione di un minuto. Dopo il karyogamy, è stata osservata la migrazione del nucleo della cellula uovo verso il micropelo.
Sia i sinergici sinistro che quello destro sono stati in grado di fungere da sinergici ricettivi. I fattori critici a cui prestare attenzione per il successo con questo metodo sono la stadiazione, l'utilizzo di terreno appena preparato, l'incorporazione degli ovuli nel mezzo, il mantenimento di un'elevata umidità e la garanzia di una bassa fototossicità. Si può anche accoppiare questa tecnica con l'imaging di eccitazione a due fotoni per un'osservazione più ravvicinata dei cambiamenti fisiologici e citologici che si verificano durante le interazioni dei gametofiti.
Si può anche accoppiare questo con la microscopia elettronica fissando gli ovuli.
