Bu yöntem, görüntüleme seansı başına yüksek verimlilikle ve yüksek örneklem büyüklüğü sayısıyla gametofit etkileşimlerinin gözlemlenmesine izin vererek Arabidopsis'te cinsel üreme üzerine araştırmaları kolaylaştıracaktır. Bu tekniğin temel avantajı, ovülleri septumda tutarak, ovüllerin miktarı ve alıcılığının önceki yöntemlere göre büyük ölçüde artmasıdır. Diseksiyon tekniği başlangıçta zor olabilir ve sabit bir el gerektirir.
Bu nedenle, deneye başlamadan önce iğdiş edilmiş pistiller üzerinde birkaç kez pratik yapmanız önerilir. Polen çimlenme ortamını metinde açıklandığı gibi hazırlayarak başlayın. Agar tamamen eritildikten sonra, ortamın 130 mikrolitresini 35 milimetrelik bir cam tabanlı kabın 14 milimetrelik kuyusuna pipetin.
Çanağı, ortam kuyuyu kaplayana kadar döndürün. Bir pipet kullanarak çanağın ortasından 40 mikrolitre ortamı aspire edin ve 90 mikrolitre ortamı geride bırakın. Ortamın eşit soğumasını sağlamak için, plakaları gece boyunca dört santigrat derecede saklamadan önce çanağı bir nem odasındaki alüminyum bir blok üzerinde soğutun.
Görüntülemeden önceki sabah, yakın zamanda septum donörleri ve stigma donörleri olarak üretmeye başlayan sağlıklı Arabidopsis bitkilerini seçin. Üç aşamalı 12B septum donör çiçeklerini ve 12 aşamalı 12B stigma donör çiçeklerini organlarını, sepallerini ve yapraklarını çıkararak iğdiş etmeden önce çiçeklenme üzerindeki yaşlı çiçekleri çıkarın. 24 saat sonra sabah, damgalama donörlerini, kolayca polen döken polen donör çiçekleriyle tozlaştırın.
Stigmalar neredeyse tamamen polenle kaplandığında tozlaşma tamamlanır. Tozlaşmadan 30 dakika sonra, pediküldeki sağlıklı ve olgun bir septum donör pistilini çıkarın ve damgalama bandın hemen kenarına yapışacak şekilde bir cam slayt üzerine monte edilmiş taze çift taraflı yapışkan bant içine yerleştirin. Pistil, yeni bir insülin şırınga iğnesinin arka tarafını kullanarak pedikül üzerine ve yumurtalık boyunca hafifçe bastırarak bant üzerine güvenli bir şekilde sabitleyin.
Emaskülasyondan arta kalan sepal, taç yaprağı ve stamen kalıntılarını çıkarın. Bir stereoskop altında, stil-yumurtalık kavşağında ve yumurtalık-pedikül kavşağında karpel başına iki kesim yapmak için bir insülin şırınga iğnesi kullanın. Daha sonra her karpelin septumu boyunca sığ kesimler yapın ve yumurtalık duvarlarını bantın üzerine geri soyun ve ovülleri açığa çıkarın.
Ovülleri rahatsız etmeden pisilin tüm uzunluğu boyunca replum'u kesmek için iğneyi iki septa arasında hafifçe kaydırın. Daha sonra üst septumu stilin yakınında kesin, böylece tüm septum kaldırılır. Daha sonra, forseps kullanarak septumu pedikülden çıkarın.
Septumu, ovüllerin mikro yığınları yukarı bakacak şekilde ortama mümkün olduğunca düz yerleştirin. Ardından, ovüller ortama hafifçe gömülene kadar septumu hafifçe bastırın. Tozlaşmış stigma donör pistillerini, yumurtalık tarzı bağlantı noktası bandın kenarından çıkacak şekilde bir cam slayt üzerine monte edilmiş taze, çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirin.
Bir tıraş bıçağı kullanarak stili doğrudan kesin ve bıçağa bağlı damgalama ile kaldırın. Stigmayı bıçaktan bir insülin şırınga iğnesi ile çıkarın ve ovüllerden yaklaşık 250 ila 300 mikrometre uzağa düz bir şekilde yerleştirin. Her septumun her iki tarafına iki tane yerleştirerek 12 stigmaya kadar transfer edin.
21 santigrat derecede% 92 bağıl nemde tutulan mikroskoptaki bir nem odasında inkübe edildikten sonra, çanak görüntüleme için hazırdır. Numuneleri düşük ışık yoğunluğunda parlak alan altında netledin, ardından floresan ışığa geçin. Ardından, görüntülenecek sahne alanına genel bakışta örneğin alanlarını işaretleyin.
İşiniz bittiğinde, her genel bakış alanının başında otomatik odaklama işlevine sahip çok aşamalı bir edinme şeması kullanarak görüntülemeye başlayın. İnkübasyondan yaklaşık yedi ila dokuz saat sonra, polen tüplerinin ovüllere çekildiğini ve yumurtalar tarafından alındığını kontrol edin. Başarılı polen tüpü alımı, ovüllerin mikroyığınındaki polen tüpünün patlayıcı bir patlamasını gösterir.
İşiniz bittiğinde, satın almayı durdurun. Yarı in vitro eksize ovül yönteminin sekiz teknik replikası yapıldı ve başarılı polen tüpü alımı için puanlandı. Yeşil kareler başarılı alımı gösterir ve kırmızı kareler kusurlu alımı gösterir.
Bu deneyler, ovüllerin yaklaşık% 28'inin patlayıcı polen tüpü patlaması gösterdiğini ve yaklaşık% 10 ila% 50 arasında değişen bir verimlilikle sonuçlandığını ortaya koymuştur Yarı in vitro cum septum yöntemini kullanarak, daha birçok ales ovülünün puanlanabildiğini ve yeşil kareli ovüllerde görüldüğü gibi bir görüntüleme seansında 40'a kadar başarılı polen tüpü alımı örneği kaydedilmiştir. Bu yöntemin beş teknik kopyası, polen tüplerini çeken ovüllerin yaklaşık% 79'unun patlayıcı bir polen tüpü patlaması gösterdiğini ve yaklaşık% 70 ila% 100 arasında değişen bir verimlilikle sonuçlandığını göstermiştir. polen tüpü yırtılması üzerine, alıcı sinergidin çekirdeğinin aynı anda bir dakikalık bir çözünürlükle bozulduğu gözlenmiştir. Karyogami sonrası yumurta hücresi çekirdeğinin mikroyığına doğru göçü görüldü.
Hem sol hem de sağ sinergidler alıcı sinergid olarak hizmet edebildiler. Bu yöntemle başarı için dikkat edilmesi gereken kritik faktörler evreleme, taze hazırlanmış ortam kullanma, ovüllerin ortama gömülmesi, yüksek nemin korunması ve düşük fototoksisitenin sağlanmasıdır. Bu tekniği, gametofit etkileşimleri sırasında meydana gelen fizyolojik ve sitolojik değişikliklerin daha yakından gözlemlenmesi için iki fotonlu uyarma görüntüleme ile de birleştirebilirsiniz.
Bunu ovülleri sabitleyerek elektron mikroskobu ile de birleştirebilirsiniz.
