Este método facilitará a pesquisa sobre reprodução sexuada em Arabidopsis por permitir a observação de interações gametófitas com alta eficiência e com alto número de amostras por sessão de imagem. A principal vantagem desta técnica é que, mantendo os óvulos no septo, a quantidade e a receptividade dos óvulos é muito aumentada em relação aos métodos anteriores. A técnica de dissecção pode ser inicialmente difícil e requer uma mão firme.
Portanto, recomenda-se praticar algumas vezes em pistilos emasculados antes de começar o experimento. Comece preparando o meio de germinação de pólen conforme explicado no texto. Depois que o ágar estiver completamente derretido, pipete 130 microlitros do meio para o poço de 14 milímetros de um prato de fundo de vidro de 35 milímetros.
Gire o prato até que o meio cubra o poço. Aspirar 40 microlitros de meio do centro da placa usando uma pipeta, deixando para trás 90 microlitros de meio. Para garantir o resfriamento uniforme do meio, resfrie o prato em um bloco de alumínio em uma câmara de umidade antes de armazenar as placas a quatro graus Celsius durante a noite.
Na manhã anterior à imagem, escolha plantas saudáveis de Arabidopsis que começaram recentemente a produzir como doadoras de septo e doadoras de estigma. Remova as flores mais velhas da inflorescência antes de emascular as flores doadoras de septo 12B em três estágios e as flores doadoras estigma 12B em 12 estágios, removendo seus estames, sépalas e pétalas. Pela manhã, 24 horas depois, polinize os doadores estigma com as flores doadoras de pólen que estão prontamente soltando pólen.
A polinização é completa quando os estigmas estão quase completamente cobertos de pólen. 30 minutos após a polinização, remova um pistilo doador de septo saudável e maduro no pedículo e coloque-o em fita adesiva dupla face fresca montada em uma lâmina de vidro com o estigma colado na borda da fita. Fixe o pistilo firmemente na fita pressionando suavemente o pedículo e ao longo do ovário usando a parte de trás de uma nova agulha de seringa de insulina.
Remova os restos de sépala, pétala e estame que sobraram da emasculação. Sob um estereoscópio, use uma agulha de seringa de insulina para fazer dois cortes por carpelo na junção estilo-ovário e na junção ovário-pedículo. Em seguida, faça cortes rasos ao longo do septo de cada carpelo e descasque as paredes do ovário na fita, expondo os óvulos.
Deslize a agulha suavemente entre os dois septos para cortar a replum ao longo de todo o comprimento do pistilo sem perturbar os óvulos. Em seguida, corte o septo superior perto do estilo para que todo o septo se levante. Em seguida, remova o septo do pedículo com pinças.
Coloque o septo o mais plano possível no meio com as micropilhas dos óvulos voltadas para cima. Em seguida, pressione o septo suavemente até que os óvulos estejam levemente embutidos no meio. Coloque os pistilos doadores de estigma polinizados em fita adesiva dupla face fresca montada em uma lâmina de vidro de tal forma que a junção em estilo ovário fique fora da borda da fita.
Corte o estilo diretamente para baixo usando uma lâmina de barbear e levante-o com o estigma preso à lâmina. Remova o estigma da lâmina com uma agulha de seringa de insulina e coloque-a a aproximadamente 250 a 300 micrômetros dos óvulos. Transferir até 12 estigmas, colocando dois de cada lado de cada septo.
Depois de incubada em uma câmara de umidade no microscópio mantida a 92% de umidade relativa em 21 graus Celsius, a placa está pronta para exames de imagem. Coloque as amostras em foco sob campo de luz a uma intensidade de luz baixa e, em seguida, mude para luz fluorescente. Em seguida, marque as áreas da amostra na visão geral do palco a serem visualizadas.
Uma vez feito, comece a criar imagens usando um esquema de aquisição de vários estágios com uma função de foco automático no início de cada área de visão geral. Aproximadamente sete a nove horas após a incubação, verifique se os tubos polínicos foram atraídos e recebidos pelos óvulos. A recepção bem-sucedida do tubo polínico mostra uma explosão explosiva do tubo polínico na micropilha dos óvulos.
Quando terminar, interrompa a aquisição. Oito réplicas técnicas do método semi in vitro de óvulos excisados foram conduzidas e pontuadas para o sucesso na recepção do tubo polínico. Quadrados verdes mostram recepção bem-sucedida e quadrados vermelhos mostram recepção defeituosa.
Esses experimentos revelaram que cerca de 28% dos óvulos apresentam explosão explosiva do tubo polínico, resultando em uma eficiência que varia de aproximadamente 10 a 50%Usando o método semi in vitro cum septum, muitos mais óvulos de ales puderam ser pontuados e até 40 casos de recepção bem-sucedida do tubo polínico foram registrados em uma sessão de imagem, como visto em óvulos com quadrados verdes. Cinco réplicas técnicas deste método mostraram que aproximadamente 79% dos óvulos que atraem tubos polínicos apresentam uma explosão do tubo polínico, resultando em uma eficiência que varia de aproximadamente 70 a 100% Após a ruptura do tubo polínico, observou-se que o núcleo do sinérgico receptivo degrada-se ao mesmo tempo com resolução de um minuto. Após a karyogamy, observou-se a migração do núcleo do óvulo em direção à micropilha.
Tanto as sinergias esquerda quanto a direita foram capazes de servir como sinérgicas receptivas. Fatores críticos a serem observados para o sucesso desse método são o estadiamento, o uso de meio recém-preparado, a incorporação dos óvulos no meio, a manutenção de alta umidade e a garantia de baixa fototoxicidade. Pode-se também acoplar esta técnica com imagens de excitação de dois fótons para uma observação mais próxima das mudanças fisiológicas e citológicas que ocorrem durante as interações gametófitas.
Pode-se também acoplar isso à microscopia eletrônica, fixando os óvulos.
