Diese Methode wird die Erforschung der sexuellen Fortpflanzung bei Arabidopsis erleichtern, indem sie die Beobachtung von Gametophyteninteraktionen mit hoher Effizienz und hoher Probengröße pro Bildgebungssitzung ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Eizellen auf dem Septum gehalten werden, wodurch die Menge und Empfänglichkeit der Eizellen gegenüber früheren Methoden stark erhöht wird. Die Präpariertechnik kann anfangs schwierig sein und erfordert eine ruhige Hand.
Daher wird empfohlen, einige Male an entmannten Stempeln zu üben, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Pollenkeimmediums, wie im Text beschrieben. Nachdem der Agar vollständig geschmolzen ist, pipettieren Sie 130 Mikroliter des Mediums in die 14-Millimeter-Vertiefung einer 35-Millimeter-Glasbodenschale.
Drehen Sie die Schüssel, bis das Medium die Vertiefung bedeckt. Saugen Sie mit einer Pipette 40 Mikroliter Medium aus der Mitte der Schale ab und lassen Sie 90 Mikroliter Medium zurück. Um eine gleichmäßige Kühlung des Mediums zu gewährleisten, kühlen Sie die Schale auf einem Aluminiumblock in einer Feuchtigkeitskammer ab, bevor Sie die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius lagern.
Wählen Sie am Morgen vor der Bildgebung gesunde Arabidopsis-Pflanzen, die vor kurzem begonnen haben, als Septumspender und Stigmaspender zu produzieren. Entfernen Sie die älteren Blüten am Blütenstand, bevor Sie die dreistufigen 12B-Septumspenderblüten und die 12-stufigen 12B-Narbenspenderblüten entmannen, indem Sie ihre Staubblätter, Kelchblätter und Blütenblätter entfernen. Bestäuben Sie die Stigmaspender am Morgen, 24 Stunden später, mit den Pollenspenderblüten, die leicht Pollen abgeben.
Die Bestäubung ist abgeschlossen, wenn die Narben fast vollständig mit Pollen bedeckt sind. Entfernen Sie 30 Minuten nach der Bestäubung einen gesunden und reifen Septumspenderstempel am Stiel und legen Sie ihn in frisches doppelseitiges Klebeband, das auf einem Objektträger montiert ist, wobei die Narbe direkt am Rand des Klebebandes klebt. Stecken Sie den Stempel sicher auf das Klebeband, indem Sie mit der Rückseite einer neuen Insulinspritzennadel vorsichtig auf den Stiel und entlang des Eierstocks drücken.
Entfernen Sie die Kelch-, Blütenblatt- und Staubblattreste, die von der Entmannung übrig geblieben sind. Verwenden Sie unter einem Stereoskop eine Insulinspritzennadel, um zwei Schnitte pro Fruchtblatt an der Stil-Eierstock-Verbindung und der Eierstock-Pedikel-Verbindung durchzuführen. Machen Sie dann flache Schnitte entlang des Septums jedes Fruchtblatts und ziehen Sie die Eierstockwände auf das Klebeband ab, wodurch die Eizellen freigelegt werden.
Schieben Sie die Nadel vorsichtig zwischen die beiden Septen, um die Replum über die gesamte Länge des Stempels zu schneiden, ohne die Eizellen zu stören. Schneiden Sie dann das obere Septum in der Nähe des Stils ab, sodass sich das gesamte Septum abhebt. Entfernen Sie anschließend das Septum mit einer Pinzette vom Stiel.
Legen Sie das Septum so flach wie möglich auf das Medium, wobei die Mikropfähle der Eizellen nach oben zeigen. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Septum, bis die Eizellen leicht in das Medium eingebettet sind. Legen Sie die bestäubten Narbenspenderstempel auf frisches, doppelseitiges Klebeband, das auf einem Objektträger montiert ist, so dass sich der Eierstockübergang vom Rand des Klebebandes entfernt.
Schneiden Sie den Stil mit einer Rasierklinge gerade nach unten und heben Sie ihn mit der an der Klinge befestigten Narbe ab. Entfernen Sie die Narbe mit einer Insulinspritzennadel von der Klinge und legen Sie sie etwa 250 bis 300 Mikrometer von den Eizellen entfernt flach. Übertragen Sie bis zu 12 Narben und platzieren Sie zwei auf jeder Seite jedes Septums.
Nach der Inkubation in einer Feuchtigkeitskammer am Mikroskop mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 92 % bei 21 Grad Celsius ist die Schale bereit für die Bildgebung. Bringen Sie die Proben unter Hellfeld mit geringer Lichtintensität in den Fokus und schalten Sie dann auf Fluoreszenzlicht um. Markieren Sie als Nächstes die Bereiche des Beispiels auf der Bühnenübersicht, die abgebildet werden sollen.
Wenn Sie fertig sind, beginnen Sie mit der Bildgebung mit einem mehrstufigen Aufnahmeschema mit einer Autofokusfunktion am Anfang jedes Übersichtsbereichs. Überprüfen Sie etwa sieben bis neun Stunden nach der Inkubation, ob die Pollenschläuche von den Eizellen angezogen und von ihnen aufgenommen wurden. Eine erfolgreiche Pollenschlauchaufnahme zeigt einen explosionsartigen Bruch des Pollenschlauchs im Mikrohaufen der Eizellen.
Wenn Sie fertig sind, stoppen Sie die Erfassung. Acht technische Replikate der semi-in-vitro-Methode der exzidierten Eizellen wurden durchgeführt und für den erfolgreichen Empfang von Pollenschläuchen bewertet. Grüne Quadrate zeigen erfolgreichen Empfang und rote Quadrate zeigen fehlerhaften Empfang an.
Diese Experimente zeigten, dass etwa 28 % der Eizellen einen explosiven Pollenschlauch platzen lassen, was zu einer Effizienz von etwa 10 bis 50 % führt. Mit der Semi-in-vitro-Cum-Septum-Methode konnten viel mehr Ales-Eizellen bewertet werden, und bis zu 40 Fälle erfolgreicher Pollenschlauch-Aufnahme wurden in einer Bildgebungssitzung aufgezeichnet, wie sie bei Eizellen mit grünen Quadraten zu sehen sind. Fünf technische Repliken dieser Methode zeigten, dass etwa 79% der Eizellen, die Pollenschläuche anziehen, einen explosiven Pollenschlauchplatzer aufweisen, was zu einem Wirkungsgrad von etwa 70 bis 100% führt. Nach der Karyogamie wurde die Wanderung des Eizellkerns in Richtung des Mikrohaufens beobachtet.
Sowohl die linken als auch die rechten Synergien konnten als rezeptive Synergien dienen. Kritische Faktoren, auf die bei dieser Methode geachtet werden muss, sind die Inszenierung, die Verwendung eines frisch zubereiteten Mediums, die Einbettung der Eizellen in das Medium, die Aufrechterhaltung einer hohen Luftfeuchtigkeit und die Gewährleistung einer geringen Phototoxizität. Man kann diese Technik auch mit der Zwei-Photonen-Anregungsbildgebung koppeln, um physiologische und zytologische Veränderungen, die bei Gametophyten-Interaktionen auftreten, genauer zu beobachten.
Man kann dies auch mit der Elektronenmikroskopie koppeln, indem man die Eizellen fixiert.
