T.C.得到了美国国家普通医学科学研究所分子生物物理学培训补助金GM-08295和美国国家科学基金会研究生研究奖学金的支持，资助号为DGE 2146752。R.G. 和 B.H. 得到了美国国立卫生研究院授予 R.G. 和 B.H. 的 R21-GM135666 资助。这项工作的部分资金来自美国国家普通医学科学研究所授予的R35-GM127018授予E.N.E.N.是霍华德休斯医学研究所的研究员。

1.试剂的制备
<ol><li>在结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5,150 mM KCl，5 mM EDTA，10%海藻糖）中将商业购买的链霉亲和素稀释至终浓度为0.5 mg/mL。确保最终海藻糖浓度为 10%。在液氮中快速冷冻25-50μL的等分试样，并储存在-80°C。</li>
	<li>将 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（生物素基）钠盐溶解在 65：35：8 v/v/v 氯仿/甲醇/水溶剂中，最终脂质浓度为 1 mg/mL。将20-30μL的一次性等分试样储存在-80°C的玻璃小瓶中。 注意：如果按重量进行，溶剂的制备更准确。首先，将 1.85 g 超纯水与 6.41 g 高效液相色谱 （HPLC） 级甲醇混合，并将其加入 22.42 g 氯仿中以制备溶剂。 注意：在开始本协议之前，请阅读并理解制造商的安全数据表以及氯仿和甲醇有机溶剂处理和处置的推荐说明。避免甲醇与皮肤直接接触。</li>
</ol>2. 网格的预处理
<ol><li>将碳箔浸入 100% 氯仿中两次，浸入 100% 乙醇中一次，在金网格上清洗碳箔。将网格放在干净的滤纸上晾干。重复洗涤过程，总共三个周期。 注意：市售碳箔网格具有 10-12 nm 厚碳的碳膜（参见材料列表），孔径范围为 0.6-2 μm，已取得了可重复的成功。按照鲁宾斯坦实验室的纳米加工协议14 制备的市售金箔网格和自制的霍利碳网格也已成功使用。使用具有较薄碳膜的市售网格获得的可重复性较低的结果。不要使用铜网格，因为铜会与样品中可能存在的任何有机胺发生反应。</li>
	<li>网格干燥后，将 2.5-5 nm 厚的碳层蒸发到有孔碳网格的碳侧。碳厚度通过石英晶体膜厚度测量进行控制，该测量内置于 材料表 文件中提供的碳蒸发器中。</li>
	<li>让新蒸发的碳老化（即变得更疏水）1周。</li>
</ol>3.链霉亲和素晶格的制备
注意：为了在holey-carbon EM网格上生长2D链霉亲和素晶体，首先，通过Langmuir-Schaefer转移将生物素化的脂质单层施加到碳膜的孔（图1B）上。脂质单层按照后续步骤形成（图2）。滑石粉在蓖麻油和培养皿之间形成边界，当脂质单层形成时，一层薄薄的蓖麻油有助于保持恒定的表面压力。含有步骤2.2中蒸发的碳的一面用于拾取单层，用结晶缓冲液洗去多余的脂质，并将链霉亲和素溶液孵育在网格上进行结晶。
<ol><li>用 70% 乙醇清洁工作台区域。</li>
	<li>用氯仿冲洗 5 μL 玻璃注射器数次以清洁。使用前让注射器完全干燥。</li>
	<li>再次清洗碳蒸发的网格，即在使用前，将它们浸入 100% 乙醇中。让网格在干净的滤纸上干燥。</li>
	<li>当网格干燥时，用 100% 氯仿和 100% 乙醇清洗每个抗毛细管镊子。让镊子完全干燥。</li>
	<li>在石蜡膜的清洁面，为将要制作的每个网格准备三滴 50 μL 结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10% 海藻糖）。</li>
	<li>用结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5,150 mM KCl，5 mM EDTA，10%海藻糖）填充35mm无涂层培养皿的盖子。用镜头纸清洁表面。</li>
	<li>在培养皿的周边撒上科学级滑石粉。随后，这可作为下一步蓖麻油扩散程度的指标。加入足够的滑石粉以形成屏障，保护蓖麻油不接触培养皿的边缘。添加过多的滑石粉会限制制造脂质单层的可用空间。</li>
	<li>将 200 μL 移液器吸头浸入蓖麻油中，以获得悬挂在移液器吸头上的中等大小的液滴（约 20 μL）。将该液滴接触培养皿中缓冲液的表面，在那里它将扩散形成均匀的薄膜。由此产生的油薄膜用作活塞15，当脂质单层形成时，活塞15保持恒定的表面压力（步骤3.10）。 注意：添加足够的蓖麻油而不是太少很重要，最好添加一滴。在制作脂质单层之前，让蓖麻油充分扩散。</li>
	<li>在取样试样使用之前，用溶解的脂质冲洗 5 μL 玻璃注射器一到两次。避免在填充注射器的脂质中产生气泡。 注意：用溶解的脂质冲洗玻璃注射器，以防步骤3.2残留任何残留的氯仿。残留的氯仿会影响所得单层的质量。</li>
	<li>从注射器中分配尽可能小体积（~0.5μL）的脂质，然后轻轻接触悬挂的液滴到蓖麻油膜的表面。请注意，脂质溶液在接触点突破蓖麻油膜，所得脂质单层在蓖麻油薄膜的中心形成一个圆圈。<ol><li>依次添加几滴脂质或在制作一些网格后添加更多脂质，但如果添加过多，脂质会扩散到蓖麻油的边界并扩散到滑石粉和任何污染表面活性剂被隔离的周边。如果发生这种情况，则需要重新启动该过程。</li>
	</ol></li>
	<li>拿起带有防毛细管镊子的网格，使镊子的直臂和网格的碳蒸发侧都面向单层。</li>
	<li>通过将网格的碳蒸发侧接触到单层 1-2 秒，将单层的一部分转移到多孔碳中。 注意：网格表面变得亲水，导致缓冲液的薄球形帽在从培养皿中取出后覆盖整个网格，表明转移成功。</li>
	<li>将现在粘附在网格上的缓冲液的球形盖按顺序接触，每个1秒，到步骤3.5中在封口膜上制备的三滴50μL结晶缓冲液上。 注意：此步骤试图尽可能多地去除覆盖球帽表面（而不是以前的疏水碳膜）的多余脂质，以避免在电子显微镜下观察样品时形成脂质囊泡。</li>
	<li>小心地将 4 μL 0.5 mg/mL 链霉亲和素加入网格上剩余的结晶缓冲液球盖中。</li>
	<li>将网格放入湿度室中。对整批网格重复步骤 3.11-3.14。</li>
	<li>在室温（RT）下将网格在湿度室内孵育2小时，以避免蒸发。 注意：重要的是，在应用单层后，网格的金色面在任何时候都不会变湿。</li>
	<li>孵育2小时后，为石蜡膜清洁侧的每个网格准备一滴300μL冲洗缓冲液（10mM HEPES，pH 7.5,50mM KCl，5mM EDTA，10%海藻糖）。 注意：冲洗缓冲液含有50mM KCl，而不是150mM KCl，后者位于用于步骤3.5-3.6的结晶缓冲液中。</li>
	<li>通过将网格放在 300 μL 冲洗缓冲液滴上来洗涤多余的（未结合）链霉亲和素。一次对一个网格执行步骤 3.18-3.20。避免将网格长时间留在 300 μL 冲洗缓冲液滴上。 注意：只进行一次洗涤，因为此时链霉亲和素晶体/单层很脆弱。每当将网格从一滴洗涤缓冲液的表面抬起时，网格和洗涤液滴之间的液体桥就会破裂。在破裂时，瞬态压力梯度（吸入压力）施加到跨越碳膜开孔的自支撑单层晶体上。预计这种吸入压力会导致单层晶体的瞬态穹顶，并伴随着晶体覆盖区域的膨胀。如果面积的增加超过晶体的弹性极限，晶体可能会破裂或变得无序。</li>
	<li>立即用无绒擦拭擦拭器擦干防毛细管镊子，以方便在下一步中将网格释放到滤纸上。通过将抗毛细管镊子的扭结臂插入液滴中，捡起漂浮在冲洗缓冲液滴上的网格。</li>
	<li>用滤纸从侧面轻轻吸干多余的缓冲液。将网格放在滤纸上，金色面朝下，对每个网格重复步骤3.18-3.20，并让网格干燥15-20分钟。</li>
	<li>网格干燥后，将它们翻转过来，使金色的一面现在朝上。将一层薄薄的碳（约 0.5-2 nm 厚）蒸发到网格的金色一侧。 注意：将网格存储在恒定湿度下，其值似乎无关紧要，请注意，相对湿度的多次变化预计会导致膨胀和收缩的循环。在使用冷冻电镜之前，让网格老化 1 周以获得最佳效果，因为网格背面的疏水性对于单层稳定性可能很重要。网格在很长一段时间内都是稳定的，但3个月后，背面的碳可能会变得不那么疏水。</li>
</ol>4. 通过阴性染色检查链霉亲和素亲和力网格批次质量
<ol><li>在封口膜的清洁面准备两滴 50 μL 和一滴 100 μL 样品缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP）。</li>
	<li>通过接触两个 50 μL 滴剂去除海藻糖并重新水化链霉亲和素网格，让网格漂浮在 100 μL 样品缓冲液液滴上 10 分钟。 注意：最好避免在补水和随后的样品结合孵育期间使用洗涤剂。缓冲液将分散到网格的金侧，并限制洗涤效率以去除多余的样品。</li>
	<li>补水后，用抗毛细管镊子将网格捡起，使抗毛细管镊子的扭结臂在滴落中。</li>
	<li>轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速重新涂抹 4 μL 75-100 nM 样品（可选）。 注意： 避免在补水后让网格干燥。</li>
	<li>将样品在湿度室中孵育1-5分钟。 注意：浓度和孵育时间将取决于样品，应进行优化。提供的样品浓度和孵育时间是建议的起点。</li>
	<li>在封口膜的清洁面，设置四滴 30 μL 样品缓冲液和 1% 甲酸铀 （UF） 染色剂。 注意： 在执行此步骤之前，请阅读并理解制造商的安全数据表以及处理和处置甲酸铀的建议说明。甲酸铀酰是一种有毒的放射性化合物。确保事先获得机构批准才能使用放射性物质。</li>
	<li>通过触摸四滴样品缓冲液中的每一滴来洗掉未结合的样品。</li>
	<li>使用UF的标准负性染色程序对样品进行染色。轻轻吸干侧面的 UF 污渍，在网格上留下一层非常厚的污渍。如果需要，可以在印迹后将额外的 0.5 μL 染色剂涂抹在网格上，以使染色剂变厚。让网格风干。 注意：由于链霉亲和素网格非常亲水，负染色往往会在任何地方形成非常均匀的薄膜，这与使用经过辉光放电处理的连续碳网格时常见的情况相反。因此，建议留下较厚的染色剂薄膜。</li>
</ol>5. 用生物素化样品冷冻链霉亲和素亲和力网格
注意：以下程序适用于包含内部印迹传感器的单侧自动柱塞（也可以在其他自动插入设备中进行单侧手动印迹）
<ol><li>在封口膜的清洁面上制备两滴 50 μL 和一滴 100 μL 样品缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP）。</li>
	<li>通过接触两个 50 μL 液滴来重水化链霉亲和素网格，并让网格漂浮在 100 μL 样品缓冲液液滴上 10 分钟。</li>
	<li>补水后，用抗毛细管镊子将网格捡起，使抗毛细管镊子的扭结臂在滴落中。</li>
	<li>轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速加入 4 μL 75-100 nM 样品。</li>
	<li>将样品在湿度室中孵育1-5分钟。 注意：同样，浓度和孵育时间将取决于样品，应进行优化。提供的样品浓度和孵育时间是建议的起点。对于低浓度的样品，可以孵育更长的时间和/或将样品与网格结合多次。</li>
	<li>在石蜡膜的清洁面上准备两滴 10 μL 冷冻缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3% 海藻糖、0.01% NP40）。孵育后，通过将网格接触冷冻缓冲液的第一滴来洗涤未结合的样品。将网格放到冷冻缓冲液的第二滴上。</li>
	<li>用镊子连接到单侧自动柱塞上，快速抓住网格的边缘。轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速将 4 μL 冷冻缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3% 海藻糖、0.01% NP40）施加到网格上。</li>
	<li>将镊子连接到单侧自动柱塞上。使用印迹传感器可检测网格上的液滴，印迹时间在 4-6 秒之间，可获得最佳结果。条件会因所使用的样品和缓冲液而异。</li>
</ol>6. 从链霉亲和素亲和力网格中收集的冷冻电镜电影的数据处理
链霉亲和素亲和素亲和网格的数据采集可以像标准网格一样进行，无需特殊的显微镜调整。然而，此处详述的程序仅在显微照片的运动校正后去除链霉亲和素信号。因此，依赖原始电影帧的数据处理步骤（例如粒子抛光）无法可靠地执行。链霉亲和素信号减法（除 CTF 估计外，所有标准下游处理都需要）需要在 Linux 环境中运行的 Matlab 版本 R2014b 或更高版本。信号减法依赖于链霉亲和素层的结晶性质，这允许峰掩蔽，从而从每个显微照片的傅里叶变换中去除信号。
<ol><li>设置处理脚本<ol><li>将“补充文件”中的所有文件复制到项目目录中的专用文件夹中</li>
		<li>准备一个名为 processing_scripts 的目录，其中包含以下文件： lsub.m （补充编码文件 1;减法脚本） process_subtration.sh （补充编码文件 2;循环所有可用显微照片、生成并行作业并跟踪输入和输出的包装脚本） process_subtraction.cfg （补充编码文件 3;包含减法作业参数的配置文件，请参见 6.2）</li>
		<li>准备一个名为 support_scripts 的目录，其中包含以下文件： bg_drill_hole.m（补充编码文件 4） bg_FastSubtract_standard.m（补充编码文件 5） bg_Pick_Amp_masked_standard.m（补充编码文件 6） bg_push_by_rot.m（补充编码文件 7） ReadMRC.m（补充编码文件 8） WriteMRC.m（补充编码文件 9） WriteMRCHeader.m（补充编码文件 10）</li>
	</ol></li>
	<li>根据需要调整配置文件（process_subtraction.cfg，（参见 图 3）：<ol><li>输入：包含 mrc 格式的运动校正显微照片的目录的路径。使用包含通配符 （？， *） 的目录或模式。 例： 输入=“/路径/到/project_directory/micrographs/” 或 输入=“/路径/到/project_directory/micrographs/*.mrc”</li>
		<li>output_dir：格子减去显微照片应写入的目录的路径。</li>
		<li>only_do_unfinished：指定 （true|false） 是否应覆盖或跳过预先存在的减去显微照片。此参数可用于在显微镜会话中间启动晶格减法脚本（默认值：true）。</li>
		<li>num_parallel_jobs：指定并行作业数。此数字取决于用于处理的硬件规格，不应高于可用内核数。在具有 32 个内核和一个网络文件系统的系统上，通过 14 个并行作业实现了最佳性能。为获得最佳性能，请使用显微照片子集优化此值。</li>
		<li>Pad_Origin_X：纵向（图像宽度<图像高度）的K3探测器或使用方形探测器（Falcon III、Falcon IV、K2）时为200，横向（图像宽度>图像高度）的K3探测器为1000。FFT 在方形盒子中执行，如果探测器具有非方形尺寸，则需要填充。</li>
		<li>Pad_Origin_Y：纵向 K3 探测器（图像宽度<图像高度）为 1000，使用方形探测器（Falcon III、Falcon IV、K2）或横向使用 K3 探测器（图像宽度>图像高度）时为 200。</li>
		<li>请勿更改 Inside_Radius_Ang （90） 和 Outside_Radius_Ang （3.0）。晶格减法在两种分辨率之间执行（单位为埃）。</li>
		<li>Pixel_Ang：以浮点值的形式提供像素大小。</li>
		<li>阈值：减去阈值截止值，以将格子替换为傅里叶空间中的背景。成功使用的值介于 1.4-1.6 之间。使用 1.42 作为起点。</li>
		<li>请勿更改 expand_pixel （10） 和 pad_out_opt （0）。expand_pixel 是一个直径值，用于在值高于阈值截止值的像素周围进行遮罩。pad_out_opt 是一个选项，用于决定输出中是否包含填充区域。</li>
		<li>addpath_m：支持脚本的路径。</li>
		<li>path_to_matlab_bin：系统的 Matlab 安装箱目录的路径。</li>
		<li>path_matlab_script：上面在步骤 6.1.2 下复制的 matlab 减法脚本 （lsub.m） 的路径。</li>
	</ol></li>
	<li>保存修改后的脚本后，运行脚本 （bash ./process_subtraction.sh ） 以从输入显微照片中减去链霉亲和素信号。如果参数 only_do_unfinished 设置为 true，则可以中断和/或重新启动脚本（请参阅步骤 6.2.3）。如果发生错误，请查看 bash 脚本中指定的参数。确保参数变量与其赋值之间没有意外的空格，因为这是常见的错误来源。</li>
	<li>使用晶格减去的图像进行标准冷冻电镜图像处理。</li>
</ol>

用于冷冻电镜结构研究的链霉亲和素亲和网格的制备

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li><li>Noble, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states.">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li><li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications.">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).</li><li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids.">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li></ol>

我们的协议描述了如何制作和使用链霉亲和素亲和网格，以及如何处理含有链霉亲和素衍射信号的数据。协议中有几个关键步骤需要特别注意。
不成功的网格批处理可以追溯到几个常见错误。最常见的错误来源来自使用过时或劣质的试剂。完全按照方案中的描述制备生物素化脂质溶液尤为重要。此外，任何杂质，例如实验室器皿上的洗涤剂残留物或皮肤上天然存在的油脂，都会影响链霉亲和素晶体的质量，从而影响所得图像的质量。因此，建议在第一次碳蒸发之前对网格进行三个清洗周期，以去除网格制造商可能存在的表面活性剂污染（步骤2.1）。此外，已观察到蓖麻油的污染或杂质会阻碍网格上的晶体形成。
制作和拾取脂质单层是一项应该练习几次以了解少量脂质的任务。在产生足够的脂质单层之前，该步骤在前两到三次失败并不罕见，这最终反映在负染网格中看到的链霉亲和素晶体的质量上（图4C）。
在网格制造过程中，切勿让网格的背面（金面、脂质面）受潮（步骤3.12-3.20），这一点很重要。如果背面确实被弄湿，建议丢弃网格。这可能导致大脂质囊泡的出现，从而破坏图像质量（图5D）（ 表1第3行）。由于应用脂质单层后洗涤不足，也可以观察到脂质囊泡（步骤3.13）。在加入链霉亲和素之前，建议在接触脂质单层后使用结晶缓冲液进行三次后续洗涤。
在海藻糖嵌入的网格上蒸发了一层薄薄的碳后，网格的背面可以润湿，而不会损坏晶格质量。例如，当样品缓冲液中含有极少量的去污剂时，经常会观察到背面的润湿。样品背面的润湿会导致样品与背面的碳薄膜的非特异性结合，从而降低防止颗粒扩散到空气-水界面的有效性，或将亲和结合用于网上纯化策略。如果可能，在没有洗涤剂的情况下将样品添加到网格中。洗涤剂和其他添加剂随后可以在网格清洗步骤中添加，也可以在玻璃化前的最后一步添加。这是使用链霉亲和素亲和力网格的一个限制;然而，如果目标是改善优先取向，则使用缓冲液（包括去污剂）进行样品制备已成功11。
一个常见的误差来源可以追溯到相对于两个碳蒸发步骤（步骤2.3和步骤3.21）的网格年龄。在该方案中，推荐的等待期为背面碳蒸发后 5-7 天，然后再使用链霉亲和素网格进行冷冻电镜。当网格在制造后过早使用时，已经观察到晶格和脂质单层从网格孔中动员出来。当网格太旧并在六个月后使用时，可以进行类似的观察（图5A）（ 表1第1行）。我们假设这一观察结果可以通过用于稳定脂质单层和链霉亲和素晶体的碳背衬的疏水性变化来解释。此外，如果将单层应用于第一碳蒸发层（步骤2.3）尚未充分老化的网格，链霉亲和素晶格可能出现马赛克（图5B）（第3行， 表1）并且在负染和冷冻电镜中均会破裂。
另一个常见的误差来源可以追溯到链霉亲和素结晶单层的脆弱性（脂质单层本身是流体的，可以可逆地膨胀或压缩）。背面碳蒸发（步骤3.21）在样品吸附、洗涤和冷冻电镜印迹过程中为单层和链霉亲和素晶格提供了关键的稳定性。在网格背面没有足够的碳蒸发的情况下，链霉亲和素晶格在印迹/冷冻后通常会出现碎片化（图5C）（ 表1第2行）。在该方案中，我们建议使用单侧自动小型冷冻机进行单侧印迹。该方法可产生高度可重现的印迹条件，可在冷冻过程中保留链霉亲和素晶格，并允许简化样品应用和印迹参数的优化。或者，其他自动浸入式冷冻设备已与手动印迹结合使用。为此，在设备设置中禁用了实际的吸墨功能，而是通过用一把镊子将吸墨纸从侧面入口伸向网格。该方法无需单面印迹和浸入式冷冻装置即可为实验室获得高质量的结果;然而，网格到网格的可重复性具有挑战性。
虽然使用链霉亲和素亲和力网格具有许多优点，但需要考虑这种方法的一些局限性。由于程序的性质，在整个过程完成之前，通常无法评估链霉亲和素晶格的质量。建议在冷冻样品之前，通过负染料快速筛选每批的质量。由于链霉亲和素晶格为原始图像贡献的信号，在某些情况下，仅从图像中评估是否存在足够数量的完整分散颗粒可能具有挑战性。出于同样的原因，除非在数据预处理管道中包含链霉亲和素信号减法程序，否则在数据采集期间无法即时处理冷冻电镜数据。由于链霉亲和素信号通常从运动校正图像中减去，而不是从帧本身中减去，因此在流行的软件套件中实现的贝叶斯抛光在使用所述减法程序时可能会失败。因此，建议在多个斑块中执行运动校正，以尽量减少从数据处理开始的粒子运动16。
尽管存在这些局限性，链霉亲和素亲和力网格仍具有许多优势。与标准开孔冷冻电镜网格相比，链霉亲和素亲和力网格提供的两个主要优势是保护样品免受空气-水界面的影响，并将低丰度 （10-100 nM） 的样品浓缩在网格上。其他支撑层，如碳和氧化石墨烯，也可以用作克服这些样品制备瓶颈的策略。在一个例子中，链霉亲和素亲和素亲和网格是获得与交联方法不相容的蛋白质-核酸相互作用的完整重建的唯一解决方案。12
链霉亲和素亲和网格提供的另一个主要优势是，对于吸附到其他支撑层（如碳或氧化石墨烯）的样品，其首选取向阻碍了获得目标样品的 3D 重建的能力。使用市售试剂盒对样品进行随机生物素化，可以将目标样品随机附着在链霉亲和素单层上，以获得更多潜在视图，以克服这一挑战。
此外，链霉亲和素亲和力网格具有基于亲和力的网格所独有的优势。链霉亲和素-生物素相互作用的高亲和力和特异性允许链霉亲和素亲和素网格与其他涉及生物素的工作流程偶联，以纯化目标复合物。在一个已发表的例子中，作者将复合物固定在链霉亲和素亲和力网格上，并孵育了大量过量的未知化学计量的结合伴侣。洗掉任何未结合的蛋白质后，获得正确组装的超级复合物，并可立即用冷冻电镜11 进行分析。未来一种可能的应用可能是将链霉亲和素结合蛋白标签、Avi-tag 系统或邻近标记方法与链霉亲和素亲和素亲和力网格相结合，以直接从重组或内源性来源提取单个蛋白质和/或蛋白质复合物，而无需标准复杂的纯化方案。
通过提供该协议，实验室应该能够轻松重现链霉亲和素亲和力网格的制造，并将其建立为通过冷冻电镜对蛋白质复合物进行结构分析的更常用的工具。

电子冷冻显微镜 （cryo-EM） 通过对以前 X 射线晶体学或核磁共振无法接触到的大型、柔性和异质样品进行大分子结构测定，彻底改变了结构生物学领域1.该方法的工作原理是将溶液中的大分子快速冷冻，以形成一层薄薄的玻璃冰，随后可以使用电子显微镜成像。近年来，显微镜硬件和图像处理软件的重大进步进一步扩大了适用于冷冻电镜高分辨率结构测定的样品类型。
尽管如此，制备薄的玻璃化样品仍然是冷冻电镜测定大分子结构的最关键步骤之一。生物样品通常是动态的、易碎的、容易变性的，有时只能少量用于冷冻电镜研究。在印迹过程中，这些颗粒与疏水性空气-水界面相互作用，这可能导致颗粒优选取向、脆性复合物的分解、样品部分或完全变性以及聚集 2,3,4。使用洗涤剂或其他表面活性剂、化学交联和吸附样品以支撑层是在冷冻过程中保存生物样品的常用策略。当样品数量有限时，氧化石墨烯5、6、7 或无定形碳8 等载体层也起到通过吸附将颗粒集中在网格上的功能。然而，这些方法并不通用或可靠，电网准备的优化可能非常耗时或完全失败。
链霉亲和素亲和素亲和网格9,10的开发是为了克服这些缺点，并提供一种温和且普遍适用的方法来隔离感兴趣的复合物并保护其免受空气-水界面的影响。这些网格利用生长在网格上单层生物素化脂质上的二维 （2D） 链霉亲和素晶格晶格。在样品本身被生物素化后（通常是稀疏和随机的，这意味着平均每个复合物一个生物素），它们可以应用于链霉亲和素包被的网格。由于样品吸附依赖于链霉亲和素和生物素之间极高的亲和力，因此这些网格可以使用低至 10 nM 的样品浓度。市售的蛋白质生物素化试剂盒和含DNA复合物的生物素化引物使得将必要的生物素部分连接到大多数感兴趣的样品上相对容易。除了在印迹过程中浓缩样品并使其远离破坏性的空气-水界面外，一个或几个赖氨酸残基的随机生物素化可以显着改善目标分子在冷冻电镜网格上的取向范围，如许多研究所证明的那样11。虽然来自底层链霉亲和素晶体的信号存在于原始图像中，但在早期数据处理过程中，可以很容易地去除涉及晶体中尖锐布拉格反射的傅里叶滤波的数据处理方案，最终能够对感兴趣的样品进行高分辨率重建11,12,13.在这里，提供了一个优化的分步方案，用于稳定生产链霉亲和素亲和力网格并随后用于冷冻电镜实验。提供的协议预计将在 2 周内完成（图 1A）。该协议的第一部分描述了试剂的制备、网格的预处理和第一个碳蒸发步骤。接下来，描述了脂质单层的制备和链霉亲和素晶体在EM网格上的生长的说明。此外，还提供了在阴性染色电镜和冷冻电镜实验中使用链霉亲和素亲和力网格的说明。最后，提供了在获得冷冻电镜数据后从显微照片中去除链霉亲和素信号的程序。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

链霉亲和素亲和素亲和网格提供了克服许多常见的冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 样品制备挑战的策略，包括样品变性和由于空气-水界面而可能发生的优先取向。然而，链霉亲和素亲和力网格目前被少数冷冻电镜实验室使用，因为它们无法在市场上买到，需要仔细的制造过程。二维链霉亲和素晶体生长到生物素化脂质单层上，该单层直接应用于标准霍利碳冷冻电镜网格。链霉亲和素和生物素之间的高亲和力相互作用允许随后结合生物素化样品，这些样品在冷冻电镜样品制备过程中受到空气-水界面的保护。此外，这些网格还提供了一种策略，用于浓缩数量有限的样品，并直接在网格上纯化感兴趣的蛋白质复合物。在这里，提供了一个分步的、优化的方案，用于稳健地制备用于冷冻电镜和阴性染色实验的链霉亲和素亲和网格。此外，还包括针对常见挑战的故障排除指南，以使更大的冷冻电镜社区更容易使用链霉亲和素亲和力网格。

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

作者聚焦：使用链霉亲和素-生物素方法增强冷冻电镜样品制备

链霉亲和素亲和网格制备用于冷冻电子显微镜样品制备

在步骤3.21中碳蒸发后（通常在一周后），链霉亲和素亲和素亲和网格可用于冷冻电镜或负染色样品制备，遵循步骤4和5中描述的程序。 图4A显示了使用K3探测器在泰坦Krios上以81,000倍放大倍率捕获的代表性显微照片，像素大小为1.05 Å，该样品用链霉亲和素亲和力网格冷冻。通过图像背景中出现的连续网格图案观察到成功的晶格形成。 通过图4A （右）所示的快速傅里叶变换（FFT）中出现的衍射图样，可以更容易地观察到这一点。数据收集后，按照本协议步骤6中概述的程序，可以通过计算屏蔽链霉亲和素晶格为图像贡献的信号，以产生可用于后续数据处理步骤的减去显微照片（图4B）。 图4B （右）中的FFT显示， 图4A （右）中观察到的衍射图谱已成功从原始图像中去除。
图4C 显示了在Tecnai 12显微镜上以49,000倍的放大倍率拍摄的示例显微照片，像素大小为1.6 Å的生物素化样品与链霉亲和素亲和网格结合，并使用甲酸铀进行阴性染色。按照本协议步骤4中概述的程序制备网格，留下较厚的染色膜。
当链霉亲和素网格制造程序不成功时，有几种常见的观察结果，在讨论部分和表1中进一步描述 。 图5 显示了这些观察的几个例子。 图5A 显示了来自六个月以上的批次的阴性染色链霉亲和素亲和网格的显微照片。单层从量子箔网格的碳箔上的孔中动员出来，并以与网格中的孔相似的尺寸进行观察。 图5B 显示了链霉亲和素晶体的一个例子，这些晶体具有高嵌合力，在样品制备过程中很容易受到干扰。 图5C 显示了来自链霉亲和素亲和力网格的代表性显微照片，其中步骤3.21中的碳蒸发太薄或被省略。链霉亲和素晶格在冷冻电镜样品制备过程中变得碎片化。 图5D 显示了一个阴性染色的链霉亲和素亲和网格，该网格受到脂质囊泡的污染，可能是由于步骤3.13期间洗涤不足或网格的金面在步骤3.13-3.20期间变湿。有关克服这些常见问题的策略，请参阅讨论部分和 表 1 。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> 图1：链霉亲和素亲和网格制造程序示意图。 （A） 链霉亲和素亲和素亲和网格制造程序的概述时间表。整个过程可以在两周内完成，需要两个碳蒸发步骤，每个步骤需要一周才能使碳充分老化。（B） 放大链霉亲和素亲和网格的网格正方形，显示制造过程完成后构成网格的层，包括带有金条和霍利碳膜的标准冷冻电镜网格、第一蒸发碳层、脂质单层、2D-链霉亲和素晶体和背面蒸发碳支撑层。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> 图 2：脂质单层和链霉亲和素结晶 （A） 图像演示了如何在小培养皿中成功形成脂质单层，利用滑石粉为蓖麻油创建边界，在形成脂质单层的同时产生恒定的表面压力。（B） 演示如何在冷冻电镜网格上生长链霉亲和素晶体的图像。首先，将网格的碳侧接触到脂质单层，然后在结晶缓冲液中连续洗涤三次。加入链霉亲和素，并将网格在湿度室中孵育2小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> 图 3：用于从显微照片中执行链霉亲和素晶格减法的 process_subtraction.cfg 文件的示例参数（步骤 6）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> 图 4：成功制备链霉亲和素亲和力网格的代表性结果。 （A） 用自制的链霉亲和素亲和素亲和网格制备的生物素化蛋白/核小体复合物的冷冻电镜显微照片。FFT 如右图所示，显示了链霉亲和素晶体衍射图。（B）在晶格减法程序之后显示与图A相同的显微照片，以从原始图像中去除2D链霉亲和素晶体中的信号。（C） 通过对与链霉亲和素亲和力网格结合的生物素化样品进行阴性染色获得的显微照片示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> 图 5：链霉亲和素亲和力网格制备失败的代表性结果。 （A） 显微照片显示，当网格超过六个月时，链霉亲和素单层从网格孔中动员。（B） 显微照片显示具有高马赛活性的链霉亲和素晶格，在冷冻电镜和负染色样品制备过程中都容易损坏。（C）显微照片显示，当步骤3.21中的碳蒸发层太薄或省略时，冷冻电镜样品制备过程中链霉亲和素晶格的碎裂。（D） 被脂质囊泡污染的代表性显微照片，可能是由于在步骤 3.13 期间洗涤不充分或在步骤 3.13-3.20 期间网格的金面变湿。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
表 1：克服链霉亲和素亲和素亲和网格制造失败期间遇到的常见挑战的故障排除指南。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
补充编码文件 1： lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充编码文件2： process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件3： process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充编码文件 4： bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件 5： bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件 6： bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充编码文件 7： bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件 8：ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件 9：WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充编码文件 10：WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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提供了用于制备链霉亲和素亲和力网格的分步方案，用于通过冷冻电子显微镜对具有挑战性的大分子样品进行结构研究。

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

冷冻电镜最近取得了许多技术进步，包括显微镜硬件本身的进步，提高了图像的整体质量，以及用于处理冷冻电镜图像的软件的发展，这些软件可以开始处理许多样品中存在的大量异质性。样品制备仍然是冷冻电镜中最大的瓶颈之一。样品量可能有限，蛋白质在玻璃化过程中往往会吸收到疏水性空气-水界面。这可能导致样品变性、较大蛋白质复合物的分解以及冷冻电镜图像中存在的优选颗粒取向。这些网格利用链霉亲和素和生物素之间的高亲和力相互作用来束缚生物素化样品并保护它们免受疏水性空气-水界面的影响。我们可以使用非常低的样品量，样品的随机生物素兴高采烈提供了一种策略，可以克服使用其他支撑层时可能观察到的优先取向问题。

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.6K 次观看.  University of California, Berkeley. 冷冻电镜最近取得了许多技术进步，包括显微镜硬件本身的进步，提高了图像的整体质量，以及用于处理冷冻电镜图像的软件的发展，这些软件可以开始处理许多样品中存在的大量异质性。样品制备仍然是冷冻电镜中最大的瓶颈之一。样品量可能有限，蛋白质在玻璃化过程中往往会吸收到疏水性空气-水界面。这可能导致样品变性、较大蛋白质复合物的分解以及冷冻电镜...

视频: 作者聚焦：使用链霉亲和素-生物素方法增强冷冻电镜样品制备

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.