Изготовление стрептавидин-аффинной сетки для пробоподготовки методом криоэлектронной микроскопии

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

4.9K Views

•

04:51 min

•

December 29th, 2023

DOI :

10.3791/66197-v

December 29th, 2023

•

Trinity Cookis¹, Paul Sauer²^,³, Simon Poepsel⁴^,⁵, Bong-Gyoon Han⁶, Dominik A. Herbst¹^,²^,⁶, Robert Glaeser⁶, Eva Nogales¹^,²^,³^,⁶

¹Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, ²California Institute for Quantitative Biology (QB3), University of California, Berkeley, ³Howard Hughes Medical Institute, University of California, Berkeley, ⁴Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), Faculty of Medicine and University Hospital, University of Cologne, ⁵Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Ageing-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, ⁶Molecular Biophysics and Integrative Bio-Imaging Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Транскрипт

В последнее время в области крио-ЭМ было достигнуто много технологических достижений, в том числе усовершенствования в самом аппаратном обеспечении микроскопа, которые улучшают общее качество изображений, а также разработки в программном обеспечении, которое используется для обработки крио-ЭМ изображений, которое может начать работать с большим количеством гетерогенности, присутствующей во многих образцах. Пробоподготовка остается одним из самых узких мест в крио-ЭМ. Количество образца может быть предельным, и белки имеют тенденцию поглощаться к гидрофобной границе воздух-вода во время витрификации.

Это может привести к денатурации образца, разрушению более крупных белковых комплексов и предпочтительной ориентации частиц, которые присутствуют на крио-ЭМ изображениях. Эти сетки используют преимущества высокоаффинного взаимодействия между стрептавидином и биотином для связывания биотинилированных образцов и защиты их от гидрофобной границы раздела воздух-вода. Мы можем работать с очень малыми объемами образцов, а случайное выделение образцов биотином предлагает стратегию преодоления проблем с предпочтительной ориентацией, которые могут наблюдаться при использовании других вспомогательных слоев.

Резюме

Смотреть дополнительные видео

JoVE

202

Главы в этом видео

0:00

Introduction