T.C. contó con el apoyo de la beca de capacitación en biofísica molecular GM-08295 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención DGE 2146752. R.G. y B.H. recibieron el apoyo de la subvención R21-GM135666 del Instituto Nacional de Salud otorgada a R.G. y B.H. Este trabajo fue parcialmente financiado a través de la subvención R35-GM127018 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales otorgada a E.N. E.N. es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Fabricación de rejillas de afinidad de estreptavidina para estudios estructurales crio-EM

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. 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R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. 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Nuestro protocolo describe cómo hacer y utilizar las rejillas de afinidad de la estreptavidina y cómo procesar los datos que contienen la señal de difracción de la estreptavidina. Hay varios pasos críticos en el protocolo que requieren una atención especial.
Los lotes de cuadrícula fallidos se remontan a varios errores comunes. La fuente más común de error proviene del uso de reactivos obsoletos o de mala calidad. Es especialmente importante preparar la solución lipídica biotinilada exactamente como se describe en el protocolo. Además, cualquier impureza, como residuos de detergente en el material de laboratorio o aceites presentes de forma natural en la piel, puede afectar a la calidad de los cristales de estreptavidina y, por tanto, a la calidad de las imágenes resultantes. Por lo tanto, se recomienda realizar tres ciclos de lavado de las rejillas antes de la primera evaporación de carbón para eliminar la posible contaminación por tensioactivos del fabricante de la rejilla (paso 2.1). Además, se ha observado que la contaminación o impureza del aceite de ricino dificulta la formación de cristales en la rejilla.
Hacer y recoger la monocapa lipídica es una tarea que debe practicarse varias veces para tener una idea de los pequeños volúmenes de lípidos. No es inusual que este paso falle las primeras dos o tres veces antes de que se pueda producir una monocapa lipídica adecuada, como se refleja en última instancia en la calidad de los cristales de estreptavidina que se observan en las rejillas teñidas negativamente (Figura 4C).
Es importante no dejar nunca que la parte trasera (lado dorado, lado lipídico) de la rejilla se moje durante el proceso de fabricación de la rejilla (pasos 3.12-3.20). En el caso de que la parte trasera se moje, se recomienda desechar la rejilla. Esto puede dar lugar a la aparición de grandes vesículas lipídicas que alteran la calidad de la imagen (Figura 5D) (Fila 3, Tabla 1). También se pueden observar vesículas lipídicas debido a un lavado insuficiente después de aplicar la monocapa lipídica (paso 3.13). Se recomiendan tres lavados posteriores con tampón de cristalización después de tocar la monocapa lipídica antes de agregar estreptavidina.
Después de que una fina capa de carbono se haya evaporado en las rejillas incrustadas en trehalosa, la parte posterior de la rejilla se puede mojar sin dañar la calidad de la celosía. Por ejemplo, la humectación de la parte posterior se observa con frecuencia cuando el tampón de muestra contiene incluso cantidades mínimas de detergente. La humectación de la parte posterior por parte de la muestra puede dar lugar a una unión inespecífica de las muestras a la fina película de carbono de la parte posterior, lo que disminuye la eficacia de evitar que las partículas se difundan a la interfaz aire-agua o el uso de la unión por afinidad para las estrategias de purificación en la red. Si es posible, agregue la muestra a la cuadrícula en ausencia de detergente. El detergente y otros aditivos pueden añadirse posteriormente durante los pasos de lavado de la rejilla o añadirse en un paso final antes de la vitrificación. Esta es una limitación para el uso de rejillas de afinidad por estreptavidina; Sin embargo, si el objetivo es mejorar la orientación preferencial, la preparación de la muestra con tampones, incluido el detergente, se ha realizado con éxito11.
Una fuente común de error puede rastrearse a la edad de las rejillas en relación con ambos pasos de evaporación de carbono (paso 2.3 y paso 3.21). En este protocolo, el período de espera recomendado es de 5 a 7 días después de la evaporación del carbono en la parte posterior antes de usar rejillas de estreptavidina para crio-EM. Cuando las rejillas se utilizan demasiado pronto después de la fabricación, se ha observado que la red y la monocapa lipídica se movilizan fuera de los orificios de la rejilla. Se puede hacer una observación similar cuando las rejillas son demasiado viejas y se utilizan después de seis meses (Figura 5A) (Fila 1, Tabla 1). Nuestra hipótesis es que esta observación se explica por los cambios en la hidrofobicidad del soporte de carbono que se aplica para estabilizar la monocapa lipídica y los cristales de estreptavidina. Además, las redes de estreptavidina pueden aparecer en mosaico (Figura 5B) (Fila 3, Tabla 1) y rotas tanto en tinción negativa como en crio-EM si la monocapa se aplica a rejillas donde la primera capa de evaporación de carbono (paso 2.3) no ha envejecido lo suficiente.
Otra fuente común de error puede rastrearse en la fragilidad de la monocapa cristalina de estreptavidina (la monocapa lipídica es en sí misma fluida y puede expandirse o comprimirse reversiblemente). La evaporación de carbono en la parte posterior (paso 3.21) proporciona una estabilidad crítica tanto a la red monocapa como a la red de estreptavidina durante el proceso de adsorción de muestras, lavado y transferencia crio-EM. En ausencia de suficiente evaporación de carbono en la parte posterior de la rejilla, las redes de estreptavidina a menudo aparecerán fragmentadas después de la transferencia/congelación (Figura 5C) (Fila 2, Tabla 1). En este protocolo, sugerimos el uso de un congelador de inmersión automatizado de un solo lado para la transferencia de un solo lado. Este método produce condiciones de transferencia altamente reproducibles que preservan la red de estreptavidina durante el proceso de congelación y permiten una optimización optimizada de la aplicación de la muestra y los parámetros de transferencia. Alternativamente, se han utilizado otros aparatos automatizados de congelación por inmersión en combinación con la transferencia manual. Para hacer esto, la función de transferencia real está deshabilitada en la configuración del dispositivo y, en su lugar, la cuadrícula se seca alcanzando con un par de pinzas que sostienen papel secante a través de la entrada lateral. Este método puede lograr resultados de alta calidad para los laboratorios sin un dispositivo de transferencia y congelación por inmersión de un solo lado; Sin embargo, la reproducibilidad de red a red es un desafío.
Si bien el uso de rejillas de afinidad por estreptavidina tiene muchas ventajas, se deben tener en cuenta algunas limitaciones de este método. Debido a la naturaleza del procedimiento, por lo general no es posible evaluar la calidad de la red de estreptavidina hasta que se haya completado todo el proceso. Se sugiere examinar rápidamente la calidad de cada lote mediante una tinción negativa antes de congelar las muestras. Debido a la señal aportada por la red de estreptavidina a las imágenes en bruto, en algunos casos puede ser difícil evaluar, solo a partir de las imágenes, si hay un número suficiente de partículas intactas y dispersas. Por la misma razón, el procesamiento sobre la marcha de los datos de crio-EM durante la adquisición de datos no es posible a menos que el procedimiento de sustracción de la señal de estreptavidina se haya incluido en la canalización de preprocesamiento de datos. Debido a que la señal de estreptavidina generalmente se resta de las imágenes corregidas por movimiento y no de los fotogramas en sí, el pulido bayesiano, tal como se implementa en las suites de software populares, puede fallar cuando se utilizan los procedimientos de sustracción como se describe. Por lo tanto, se recomienda realizar la corrección de movimiento en varios parches para minimizar el movimiento de partículas desde el inicio del procesamiento de datos16.
A pesar de estas limitaciones, las rejillas de afinidad de estreptavidina ofrecen muchas ventajas. Dos de las principales ventajas que proporcionan las rejillas de afinidad de estreptavidina sobre las rejillas crio-EM estándar de agujero abierto son un medio para proteger las muestras de la interfaz aire-agua y concentrar muestras de baja abundancia (10-100 nM) en la rejilla. Otras capas de soporte, como el carbono y el óxido de grafeno, también se pueden utilizar como estrategias para superar estos cuellos de botella en la preparación de muestras. En un ejemplo, las rejillas de afinidad de estreptavidina fueron la única solución para obtener una reconstrucción intacta de una interacción proteína-ácido nucleico que era incompatible con los enfoques de reticulación. 12
Otra gran ventaja que proporcionan las rejillas de afinidad de estreptavidina es una solución a muestras que se adsorben a otras capas de soporte, como el carbono o el óxido de grafeno, con orientaciones preferidas que dificultan la capacidad de obtener una reconstrucción 3D de la muestra de interés. La biotinilación aleatoria de muestras utilizando kits disponibles en el mercado permite la unión aleatoria de la muestra de interés a la monocapa de estreptavidina para obtener más vistas potenciales para superar este desafío.
Además, las rejillas de afinidad de estreptavidina ofrecen ventajas que son exclusivas de las rejillas basadas en afinidad. La alta afinidad y especificidad de la interacción estreptavidina-biotina permite el acoplamiento de las rejillas de afinidad de estreptavidina con otros flujos de trabajo que involucran biotina para purificar complejos de interés. En un ejemplo publicado, los autores inmovilizaron un complejo en rejillas de afinidad de estreptavidina e incubaron un compañero de unión de estequiometría desconocida en gran exceso. Después de lavar cualquier proteína no unida, se obtuvo el supercomplejo correctamente ensamblado y se pudo analizar inmediatamente con crio-EM11. Una posible aplicación futura puede ser la combinación de marcadores de proteínas de unión a estreptavidina, el sistema Avi-tag o enfoques de marcaje de proximidad con rejillas de afinidad de estreptavidina para extraer proteínas individuales y/o complejos proteicos directamente de fuentes recombinantes o endógenas sin esquemas de purificación estándar elaborados.
Al proporcionar este protocolo, los laboratorios deberían ser capaces de reproducir fácilmente la fabricación de rejillas de afinidad de estreptavidina y establecerlas como una herramienta más utilizada para el análisis estructural de complejos proteicos mediante crio-EM.

La criomicroscopía electrónica (crio-EM) ha revolucionado el campo de la biología estructural al permitir la determinación de la estructura macromolecular de muestras grandes, flexibles y heterogéneas que antes eran inaccesibles mediante cristalografía de rayos X o resonanciamagnética nuclear. Este método funciona mediante la congelación instantánea de macromoléculas en solución para crear una fina capa de hielo vítreo que puede ser posteriormente fotografiada con un microscopio electrónico. En los últimos años, los avances significativos tanto en el hardware del microscopio como en el software de procesamiento de imágenes han ampliado aún más los tipos de muestras adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución mediante crio-EM.
Sin embargo, la preparación de muestras finas y vitrificadas sigue siendo uno de los pasos más críticos en la determinación de la estructura macromolecular mediante crio-EM. Las muestras biológicas suelen ser dinámicas, frágiles, propensas a la desnaturalización y, a veces, solo están disponibles en pequeñas cantidades para estudios crioelectromagnéticos. Durante el proceso de transferencia, estas partículas interactúan con la interfaz hidrofóbica aire-agua, lo que puede dar lugar a orientaciones preferidas por las partículas, desmontaje de complejos frágiles, desnaturalización parcial o completa de la muestra y agregación 2,3,4. El uso de detergentes u otros tensioactivos, la reticulación química y la adsorción de muestras para soportar capas son estrategias comunes para preservar muestras biológicas durante el proceso de congelación. Las capas de soporte como el óxido de grafeno 5,6,7 o el carbono amorfo8 también funcionan para concentrar partículas en la rejilla por adsorción cuando la muestra está disponible en cantidades limitadas. Sin embargo, estos métodos no son generales ni fiables, y la optimización de la preparación de la red puede llevar mucho tiempo o fallar por completo.
Las rejillas de afinidad de estreptavidina 9,10 se desarrollaron para superar estas deficiencias y proporcionar un método suave y de aplicación general para secuestrar el complejo de interés y protegerlo de la interfaz aire-agua. Estas rejillas utilizan una red cristalina de estreptavidina bidimensional (2D) que crece sobre una monocapa de lípidos biotinilados en la rejilla. Después de que las muestras se biotinilan (a menudo de forma escasa y aleatoria, lo que significa una biotina por complejo en promedio), se pueden aplicar a la rejilla recubierta de estreptavidina. Debido a que la adsorción de muestras se basa en la afinidad extremadamente alta entre la estreptavidina y la biotina, se pueden usar concentraciones de muestra tan bajas como 10 nM con estas rejillas. Los kits de biotinilación disponibles en el mercado para proteínas y cebadores biotinilados para complejos que contienen ADN hacen que sea relativamente fácil unir los restos de biotina necesarios a la mayoría de las muestras de interés. Además de concentrar la muestra y mantenerla alejada de la dañina interfaz aire-agua durante el blot, la biotinilación aleatoria de uno o pocos residuos de lisina puede mejorar significativamente el rango de orientaciones de la molécula de interés en la rejilla crio-EM, como se ha demostrado en varios estudios11. Si bien la señal del cristal de estreptavidina subyacente está presente en las imágenes sin procesar, los esquemas de procesamiento de datos que involucran la filtración de Fourier de las reflexiones nítidas de Bragg del cristal pueden eliminarse fácilmente durante el procesamiento temprano de los datos, lo que en última instancia permite reconstrucciones de alta resolución de la muestra de interés 11,12,13. Aquí, se proporciona un protocolo optimizado, paso a paso, para la producción robusta de rejillas de afinidad de estreptavidina y su posterior uso en experimentos de crio-EM. Se espera que el protocolo proporcionado se complete en un período de 2 semanas (Figura 1A). Las primeras partes del protocolo describen la preparación de los reactivos, el pretratamiento de las rejillas y los primeros pasos de evaporación del carbono. A continuación, se describen las instrucciones para la preparación de la monocapa lipídica y el crecimiento de cristales de estreptavidina en las rejillas EM. Además, se proporcionan instrucciones para el uso de rejillas de afinidad de estreptavidina en experimentos de EM de tinción negativa y crio-EM. Por último, se proporcionan procedimientos para eliminar la señal de estreptavidina de las micrografías una vez que se han adquirido los datos de crio-EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

Las rejillas de afinidad de estreptavidina proporcionan estrategias para superar muchos de los desafíos de preparación de muestras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) que se encuentran con frecuencia, incluida la desnaturalización de la muestra y las orientaciones preferenciales que pueden ocurrir debido a la interfaz aire-agua. Sin embargo, las rejillas de afinidad de estreptavidina son utilizadas actualmente por pocos laboratorios de crio-EM porque no están disponibles comercialmente y requieren un proceso de fabricación cuidadoso. Los cristales bidimensionales de estreptavidina se cultivan en una monocapa lipídica biotinilada que se aplica directamente a las rejillas crio-EM de carbono perforado estándar. La interacción de alta afinidad entre la estreptavidina y la biotina permite la posterior unión de muestras biotiniladas que están protegidas de la interfaz aire-agua durante la preparación de muestras crio-EM. Además, estas rejillas proporcionan una estrategia para concentrar muestras disponibles en cantidades limitadas y purificar complejos proteicos de interés directamente en las rejillas. Aquí, se proporciona un protocolo optimizado paso a paso para la fabricación robusta de rejillas de afinidad de estreptavidina para su uso en experimentos de crio-EM y tinción negativa. Además, se incluye una guía de solución de problemas para los desafíos más experimentados para hacer que el uso de las rejillas de afinidad de estreptavidina sea más accesible para la comunidad crio-EM en general.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

Autor destacado: Mejora de la preparación de muestras de crio-EM con el enfoque de estreptavidina-biotina

Fabricación de rejilla de afinidad de estreptavidina para la preparación de muestras de criomicroscopía electrónica

Después de la evaporación del carbono en el paso 3.21 (generalmente después de una semana), se pueden usar rejillas de afinidad de estreptavidina para la preparación de muestras crio-EM o de tinción negativa siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 4 y 5. En la Figura 4A se muestra una micrografía representativa capturada con un detector K3 en un titán Krios a un aumento de 81.000X con un tamaño de píxel de 1,05 Å de una muestra biotinilada congelada con rejillas de afinidad de estreptavidina. La formación exitosa de la red se observa por el patrón de cuadrícula continua que aparece en el fondo de la imagen. Esto se puede observar más fácilmente por el patrón de difracción que aparece en la transformada rápida de Fourier (FFT) que se muestra en la Figura 4A (derecha). Después de la recolección de datos, siguiendo el procedimiento descrito en el paso 6 de este protocolo, la señal que es aportada a la imagen por la red de estreptavidina se puede enmascarar computacionalmente para producir una micrografía sustraída (Figura 4B) que se puede usar para los pasos posteriores de procesamiento de datos. La FFT de la Figura 4B (derecha) muestra que el patrón de difracción observado en la Figura 4A (derecha) se ha eliminado con éxito de la imagen original.
La figura 4C muestra un ejemplo de micrografía tomada con un microscopio Tecnai 12 a un aumento de 49.000x con un tamaño de píxel de 1,6 Å de una muestra biotinilada unida a rejillas de afinidad de estreptavidina y teñida negativamente con formiato de uranilo. Las rejillas se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en el paso 4 de este protocolo, dejando una película de tinte más gruesa.
Hay varias observaciones comunes cuando el procedimiento de fabricación de la rejilla de estreptavidina no tiene éxito y que se describen con más detalle en la sección de discusión y en la Tabla 1. Figura 5 muestra varios ejemplos de estas observaciones. La figura 5A muestra una micrografía de una rejilla de afinidad de estreptavidina teñida negativamente utilizada a partir de un lote de más de seis meses de antigüedad. La monocapa se ha movilizado desde los agujeros en la lámina de carbono de las rejillas quantifoil y se observa con dimensiones similares a los agujeros de la rejilla. La Figura 5B muestra un ejemplo de cristales de estreptavidina que tienen una alta mosaicidad que se perturban fácilmente durante los procedimientos de preparación de muestras. La Figura 5C muestra una micrografía representativa de una cuadrícula de afinidad de estreptavidina en la que la evaporación de carbono en el paso 3.21 es demasiado delgada u omitida. La red de estreptavidina se ha fragmentado durante el proceso de preparación de la muestra crio-EM. La Figura 5D muestra una rejilla de afinidad de estreptavidina teñida negativamente que tiene contaminación de vesículas lipídicas, probablemente debido a lavados insuficientes durante el paso 3.13 o al lado dorado de la rejilla que se humedece durante los pasos 3.13-3.20. Consulte la sección de discusión y la Tabla 1 para conocer las estrategias para superar estos problemas comunes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del procedimiento de fabricación de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Cronología general del procedimiento de fabricación de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. Todo el procedimiento se puede completar durante dos semanas, lo que requiere dos pasos de evaporación de carbono y una semana después de cada uno para permitir que el carbono envejezca lo suficiente. (B) Vista ampliada de un cuadrado de cuadrícula de una cuadrícula de afinidad de estreptavidina que muestra las capas que componen la cuadrícula después de completar el proceso de fabricación, incluida la cuadrícula crio-EM estándar con barras de oro y película de carbono agujereada, la primera capa de carbono evaporado, la monocapa lipídica, el cristal de estreptavidina 2D y la capa de soporte de carbono evaporado posterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Figura 2: Monocapa lipídica y cristalización de estreptavidina (A) Imágenes que demuestran cómo formar con éxito la monocapa lipídica dentro de la pequeña placa de Petri utilizando polvos de talco para crear un límite para el aceite de ricino que crea una presión superficial constante mientras forma la monocapa lipídica. (B) Imágenes que demuestran cómo cultivar cristales de estreptavidina en rejillas crio-EM. Primero, el lado de carbono de las rejillas se toca con la monocapa lipídica y luego se realizan tres lavados consecutivos en el tampón de cristalización. Se añade estreptavidina y las rejillas se incuban en una cámara de humedad durante 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Figura 3: Parámetros de ejemplo para el archivo process_subtraction.cfg para realizar la sustracción de la red de estreptavidina a partir de micrografías (paso 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos de la fabricación exitosa de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Micrografía crio-EM de complejos proteína/nucleosoma biotinilados preparados con rejillas de afinidad de estreptavidina caseras. La FFT se muestra a la derecha y muestra el patrón de difracción de cristales de estreptavidina. (B) Se muestra la misma micrografía que en el panel A siguiendo el procedimiento de sustracción de celosía para eliminar la señal del cristal de estreptavidina 2D de la imagen original. (C) Un ejemplo de una micrografía obtenida a partir de la tinción negativa de una muestra biotinilada unida a rejillas de afinidad por estreptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos de la fabricación fallida de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Micrografía que muestra la movilización de la monocapa de estreptavidina de los orificios de la rejilla cuando las rejillas tienen más de seis meses. (B) Micrografía que muestre redes de estreptavidina con alta mosaicidad que se dañan fácilmente durante los procedimientos de preparación de muestras crio-EM y de tinción negativa. (C) Micrografía que muestre la fragmentación de la red de estreptavidina durante la preparación de la muestra crio-EM cuando la capa de evaporación de carbono en el paso 3.21 es demasiado delgada o se omite. (D) Micrografía representativa que esté contaminada con vesículas lipídicas probablemente debido a un lavado insuficiente durante el paso 3.13 o al hecho de que el lado dorado de la rejilla se humedezca durante los pasos 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Guía de solución de problemas para superar los desafíos comúnmente experimentados que se encuentran durante la fabricación fallida de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Se proporciona un protocolo paso a paso para la fabricación de rejillas de afinidad de estreptavidina para su uso en estudios estructurales de muestras macromoleculares desafiantes mediante criomicroscopía electrónica.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Ha habido muchos avances tecnológicos recientes en crio-EM, incluidos los avances en el hardware del microscopio en sí mismo que mejoran la calidad general de las imágenes, y también los desarrollos en el software que se utilizan para procesar las imágenes crio-EM que pueden comenzar a lidiar con las grandes cantidades de heterogeneidad presentes en muchas de las muestras. La preparación de muestras sigue siendo uno de los mayores cuellos de botella en la crio-EM. La cantidad de muestra puede ser limitante y las proteínas tienden a absorber la interfaz hidrofóbica aire-agua durante la vitrificación.Esto puede conducir a la desnaturalización de la muestra, la ruptura de complejos proteicos más grandes y las orientaciones de partículas preferidas que están presentes en las imágenes crio-EM. Estas rejillas aprovechan la interacción de alta afinidad entre la estreptavidina y la biotina para atar muestras biotiniladas y protegerlas de la interfaz hidrofóbica aire-agua. Podemos trabajar con cantidades de muestra muy bajas, y la elación aleatoria de biotina de las muestras ofrece una estrategia para superar los problemas de orientación preferencial que pueden observarse cuando se utilizan otras capas de soporte.

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JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.6K vistas.  University of California, Berkeley. Ha habido muchos avances tecnológicos recientes en crio-EM, incluidos los avances en el hardware del microscopio en sí mismo que mejoran la calidad general de las imágenes, y también los desarrollos en el software que se utilizan para procesar las imágenes crio-EM que pueden comenzar a lidiar con las grandes cantidades de heterogeneidad presentes en muchas de las muestras. La preparación de muestras sigue siendo uno de los mayores cuellos de botella en la crio-EM. La cantidad de muestra...

Video: Autor destacado: Mejora de la preparación de muestras de crio-EM con el enfoque de estreptavidina-biotina

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.