T.C., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü moleküler biyofizik eğitim hibesi GM-08295 ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu tarafından DGE 2146752 hibe numarası altında desteklenmiştir. R.G. ve B.H., R.G. ve B.H.'ye verilen Ulusal Sağlık Enstitüsü hibesi R21-GM135666 tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü hibesi R35-GM127018 tarafından finanse edildi ve EN'ye verildi.

Cryo-EM Yapısal Çalışmaları için Streptavidin Afinite Izgaralarının İmalatı

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257 (2018).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM.">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li><li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide:+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples.">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li><li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy.">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li><li>Han, B. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules.">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li><li>Han, B. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals.">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li><li>Dom&#237;nguez-Mart&#237;n, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states.">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li><li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications.">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).</li><li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids.">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li></ol>

Protokolümüz, streptavidin afinite ızgaralarının nasıl yapılacağını ve kullanılacağını ve streptavidin kırınım sinyalini içeren verilerin nasıl işleneceğini açıklar. Protokolde özel dikkat gerektiren birkaç kritik adım vardır.
Başarısız ızgara grupları, birkaç yaygın hataya kadar izlenebilir. En yaygın hata kaynağı, eski veya düşük kaliteli reaktiflerin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Biyotinillenmiş lipid çözeltisinin tam olarak protokolde tarif edildiği gibi hazırlanması özellikle önemlidir. Ayrıca, laboratuvar gereçleri üzerindeki deterjan kalıntısı veya ciltte doğal olarak bulunan yağlar gibi herhangi bir kirlilik, streptavidin kristallerinin kalitesini ve dolayısıyla ortaya çıkan görüntülerin kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, ızgara üreticisinden olası yüzey aktif madde kontaminasyonunu gidermek için ilk karbon buharlaştırmadan önce ızgaralar için üç yıkama döngüsü gerçekleştirilmesi önerilir (adım 2.1). Ek olarak, hint yağının kirlenmesinin veya safsızlığının ızgarada kristal oluşumunu engellediği gözlemlenmiştir.
Lipid tek tabakasını yapmak ve almak, küçük lipid hacimleri hakkında bir fikir edinmek için birkaç kez uygulanması gereken bir görevdir. Bu adımın, negatif lekeli ızgaralarda görülen streptavidin kristallerinin kalitesine yansıdığı gibi, yeterli bir lipit tek tabakası üretilmeden önce ilk iki veya üç kez başarısız olması alışılmadık bir durum değildir (Şekil 4C).
Izgara üretim işlemi sırasında ızgaranın arka tarafının (altın tarafı, lipid tarafı) ıslanmasına asla izin vermemek önemlidir (adım 3.12-3.20). Arka tarafın ıslanması durumunda, ızgaranın atılması önerilir. Bu, görüntü kalitesini bozan büyük lipid veziküllerinin ortaya çıkmasına neden olabilir (Şekil 5D) (Satır 3, Tablo 1). Lipid tek tabakası uygulandıktan sonra yetersiz yıkama nedeniyle lipit vezikülleri de gözlenebilir (adım 3.13). Streptavidin eklenmeden önce lipid tek tabakasına dokunduktan sonra kristalizasyon tamponu kullanılarak üç müteakip yıkama önerilir.
İnce bir karbon tabakası trehaloz gömülü ızgaralar üzerinde buharlaştırıldıktan sonra, ızgaranın arka tarafı kafes kalitesine zarar vermeden ıslanabilir. Örneğin, numune tamponu minimum miktarda deterjan içerdiğinde arka tarafın ıslanması sıklıkla gözlenir. Arka tarafın numune tarafından ıslatılması, numunelerin arka taraftaki ince karbon filme spesifik olmayan bağlanmasına neden olabilir, bu da partiküllerin hava-su arayüzüne yayılmasını önlemenin etkinliğini veya şebeke üzerinde saflaştırma stratejileri için afinite bağlamasının kullanımını azaltır. Mümkünse, deterjan yokluğunda numuneyi ızgaraya ekleyin. Deterjan ve diğer katkı maddeleri daha sonra ızgara yıkama adımları sırasında eklenebilir veya vitrifikasyondan önceki son adımda eklenebilir. Bu, streptavidin afinite ızgaralarının kullanımına ilişkin bir sınırlamadır; Bununla birlikte, amaç tercihli yönelimi iyileştirmekse, deterjan da dahil olmak üzere tamponlarla numune hazırlama başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir11.
Yaygın bir hata kaynağı, her iki karbon buharlaşma adımına göre ızgaraların yaşına kadar izlenebilir (adım 2.3 ve adım 3.21). Bu protokolde, kriyo-EM için streptavidin ızgaraları kullanılmadan önce önerilen bekleme süresi, arka taraftaki karbon buharlaşmasından sonra 5-7 gündür. İmalattan çok kısa bir süre sonra ızgaralar kullanıldığında, kafes ve lipid tek tabakasının ızgara deliklerinden dışarı hareket ettiği gözlemlenmiştir. Benzer bir gözlem, ızgaralar çok eski olduğunda ve altı ay sonra kullanıldığında yapılabilir (Şekil 5A) (Satır 1, Tablo 1). Bu gözlemin, lipid tek tabakasını ve streptavidin kristallerini stabilize etmek için uygulanan karbon desteğinin hidrofobikliğindeki değişikliklerle açıklandığını varsayıyoruz. Ek olarak, streptavidin kafesleri mozaik görünebilir (Şekil 5B) (Satır 3, Tablo 1) ve tek tabaka ilk karbon buharlaşma tabakasının (adım 2.3) yeterince yaşlanmadığı ızgaralara uygulanırsa hem negatif leke hem de kriyo-EM'de kırılabilir.
Ek bir yaygın hata kaynağı, streptavidin kristalinin tek tabakasının kırılganlığına kadar izlenebilir (lipid tek tabakasının kendisi sıvıdır ve geri dönüşümlü olarak genişleyebilir veya sıkışabilir). Arka taraftaki karbon buharlaşması (adım 3.21), numune adsorpsiyonu, yıkama ve kriyo-EM lekeleme işlemi sırasında hem tek tabaka hem de streptavidin kafesi için kritik stabilite sağlar. Izgaranın arka tarafında yeterli karbon buharlaşmasının olmaması durumunda, streptavidin kafesleri genellikle lekelenme/donma işleminden sonra parçalanmış görünecektir (Şekil 5C) (Satır 2, Tablo 1). Bu protokolde, tek taraflı lekeleme için tek taraflı otomatik dalma dondurucu kullanılmasını öneriyoruz. Bu yöntem, dondurma işlemi sırasında streptavidin kafesini koruyan ve numune uygulamasının ve lekeleme parametrelerinin kolaylaştırılmış optimizasyonuna izin veren, yüksek oranda tekrarlanabilir lekeleme koşulları sağlar. Alternatif olarak, manuel lekeleme ile birlikte diğer otomatik daldırmalı dondurma aparatları kullanılmıştır. Bunu yapmak için, cihaz ayarlarında gerçek lekeleme işlevi devre dışı bırakılır ve bunun yerine ızgara, yan girişten kurutma kağıdı tutan bir cımbızla ulaşılarak lekelenir. Bu yöntem, tek taraflı lekeleme ve daldırmalı dondurma cihazı olmayan laboratuvarlar için yüksek kaliteli sonuçlar elde edebilir; Bununla birlikte, şebekeden şebekeye tekrarlanabilirlik zordur.
Streptavidin afinite ızgaralarının kullanılması birçok avantaja sahip olsa da, bu yöntemin bazı sınırlamalarının dikkate alınması gerekir. Prosedürün doğası gereği, tüm süreç tamamlanana kadar streptavidin kafesinin kalitesini değerlendirmek genellikle mümkün değildir. Numuneleri dondurmadan önce her partinin kalitesinin negatif leke ile hızlı bir şekilde taranması önerilir. Streptavidin kafesinin ham görüntülere katkıda bulunduğu sinyal nedeniyle, bazı durumlarda, yalnızca görüntülerden, yeterli sayıda bozulmamış, dağılmış parçacık olup olmadığını değerlendirmek zor olabilir. Aynı nedenden ötürü, veri toplama sırasında kriyo-EM verilerinin anında işlenmesi, streptavidin sinyal çıkarma prosedürü veri ön işleme hattına dahil edilmedikçe mümkün değildir. Streptavidin sinyali genellikle çerçevelerin kendisinden değil, hareket düzeltmeli görüntülerden çıkarıldığından, popüler yazılım paketlerinde uygulandığı gibi Bayes parlatma, açıklandığı gibi çıkarma prosedürleri kullanılırken başarısız olabilir. Bu nedenle, veri işlemenin başlangıcından itibaren parçacık hareketini en aza indirmek için birden fazla yamada hareket düzeltmesi yapılması önerilir16.
Bu sınırlamalara rağmen, streptavidin afinite ızgaraları birçok avantaj sunar. Streptavidin afinite ızgaralarının standart açık delikli kriyo-EM ızgaralarına göre sağladığı iki büyük avantaj, numuneleri hava-su arayüzünden korumak ve düşük bolluktaki (10-100 nM) numuneleri ızgara üzerinde konsantre etmek için bir araçtır. Karbon ve grafen oksit gibi diğer destek katmanları da bu numune hazırlama darboğazlarının üstesinden gelmek için stratejiler olarak kullanılabilir. Bir örnekte, streptavidin afinite ızgaraları, çapraz bağlama yaklaşımlarıyla uyumsuz olan bir protein-nükleik asit etkileşiminin bozulmamış bir yeniden inşasını elde etmek için tek çözümdü. 12
Streptavidin afinite ızgaralarının sağladığı bir diğer önemli avantaj, karbon veya grafen oksit gibi diğer destek katmanlarına adsorbe olan numunelere, ilgilenilen numunenin 3D rekonstrüksiyonunu elde etme yeteneğini engelleyen tercih edilen oryantasyonlara sahip bir çözümdür. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak numunelerin rastgele biyotinilasyonu, bu zorluğun üstesinden gelmek için daha fazla potansiyel görünüm elde etmek için ilgilenilen numunenin streptavidin tek tabakasına rastgele bağlanmasına izin verir.
Ek olarak, streptavidin afinite ızgaraları, afinite tabanlı ızgaralara özgü avantajlar sunar. Streptavidin-biyotin etkileşiminin yüksek afinitesi ve özgüllüğü, ilgilenilen kompleksleri saflaştırmak için streptavidin afinite ızgaralarının biyotin içeren diğer iş akışlarıyla birleştirilmesine izin verir. Yayınlanmış bir örnekte, yazarlar streptavidin afinite ızgaraları üzerinde bir kompleksi hareketsiz hale getirdiler ve bilinmeyen stokiyometrinin bağlayıcı bir partnerini büyük ölçüde inkübe ettiler. Herhangi bir bağlanmamış proteini yıkadıktan sonra, doğru şekilde bir araya getirilmiş süper kompleks elde edildi ve hemen cryo-EM11 ile analiz edilebildi. Gelecekteki olası bir uygulama, streptavidin bağlayıcı protein etiketlerini, Avi-tag sistemini veya yakınlık etiketleme yaklaşımlarını, standart ayrıntılı saflaştırma şemaları olmadan doğrudan rekombinant veya endojen kaynaklardan tek proteinleri ve / veya protein komplekslerini çıkarmak için streptavidin afinite ızgaraları ile birleştirmek olabilir.
Bu protokolü sağlayarak, laboratuvarlar streptavidin afinite ızgaralarının imalatını kolayca yeniden üretebilmeli ve bunları kriyo-EM ile protein komplekslerinin yapısal analizi için daha yaygın olarak kullanılan bir araç olarak kurabilmelidir.

Elektron kriyo-mikroskobu (kriyo-EM), daha önce X-ışını kristalografisi veya nükleer manyetik rezonans1 ile erişilemeyen büyük, esnek ve heterojen numunelerin makromoleküler yapı tayinini sağlayarak yapısal biyoloji alanında devrim yaratmıştır. Bu yöntem, daha sonra bir elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenebilen ince bir camsı buz tabakası oluşturmak için makromolekülleri çözelti içinde hızlı dondurarak çalışır. Son yıllarda, hem mikroskop donanımı hem de görüntü işleme yazılımındaki önemli gelişmeler, kriyo-EM ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için uygun numune türlerini daha da genişletmiştir.
Bununla birlikte, ince, vitrifiye numunelerin hazırlanması, kriyo-EM ile makromoleküler yapı tayininde en kritik adımlardan biri olmaya devam etmektedir. Biyolojik numuneler genellikle dinamiktir, kırılgandır, denatürasyona eğilimlidir ve bazen kriyo-EM çalışmaları için sadece küçük miktarlarda bulunur. Lekeleme işlemi sırasında, bu parçacıklar hidrofobik hava-su arayüzü ile etkileşime girer, bu da parçacık tarafından tercih edilen oryantasyonlara, kırılgan komplekslerin sökülmesine, kısmi veya tam numune denatürasyonuna ve agregasyonaneden olabilir 2,3,4. Deterjanların veya diğer yüzey aktif maddelerin kullanımı, kimyasal çapraz bağlama ve katmanları desteklemek için numunelerin adsorpsiyonu, dondurma işlemi sırasında biyolojik numuneleri korumak için yaygın stratejilerdir. Grafen oksit 5,6,7 veya amorf karbon8 gibi destek katmanları, numune sınırlı miktarlarda mevcut olduğunda, partikülleri adsorpsiyon yoluyla ızgara üzerinde konsantre etme işlevi de görür. Bununla birlikte, bu yöntemler genel veya güvenilir değildir ve şebeke hazırlığının optimizasyonu son derece zaman alıcı olabilir veya tamamen başarısız olabilir.
Streptavidin afinite ızgaraları 9,10, bu eksikliklerin üstesinden gelmek ve ilgilenilen kompleksi tecrit etmek ve onu hava-su arayüzünden korumak için hafif ve genel olarak uygulanabilir bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir. Bu ızgaralar, ızgara üzerinde tek bir biyotinillenmiş lipit tabakası üzerinde büyütülen iki boyutlu (2D) bir streptavidin kristal kafesi kullanır. Numunelerin kendileri biyotinillendikten sonra (genellikle seyrek ve rastgele, ortalama olarak kompleks başına bir biyotin anlamına gelir), streptavidin kaplı ızgaraya uygulanabilirler. Numune adsorpsiyonu, streptavidin ve biotin arasındaki son derece yüksek afiniteye dayandığından, bu ızgaralarla 10 nM kadar düşük numune konsantrasyonları kullanılabilir. Proteinler için ticari olarak temin edilebilen biyotinilasyon kitleri ve DNA içeren kompleksler için biyotinillenmiş primerler, ilgilenilen çoğu örneğe gerekli biyotin kısımlarının eklenmesini nispeten kolaylaştırır. Numuneyi konsantre etmenin ve lekeleme sırasında zararlı hava-su arayüzünden uzak tutmanın yanı sıra, bir veya sadece birkaç lizin kalıntısının rastgele biyotinilasyonu, bir dizi çalışmada gösterildiği gibi, kriyo-EM ızgarası üzerindeki ilgilenilen molekülün oryantasyon aralığını önemli ölçüde iyileştirebilir11. Altta yatan streptavidin kristalinden gelen sinyal ham görüntülerde mevcut olsa da, kristalden gelen keskin Bragg yansımalarının Fourier filtrasyonunu içeren veri işleme şemaları, erken veri işleme sırasında kolayca çıkarılabilir ve sonuçta ilgilenilen numunenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlarını mümkün kılar 11,12,13. Burada, streptavidin afinite ızgaralarının sağlam üretimi ve daha sonra kriyo-EM deneylerinde kullanılması için optimize edilmiş, adım adım bir protokol sağlanmıştır. Sağlanan protokolün 2 haftalık bir süre içinde tamamlanması beklenmektedir (Şekil 1A). Protokolün ilk bölümleri, reaktiflerin hazırlanmasını, ızgaraların ön işlemini ve ilk karbon buharlaştırma adımlarını açıklar. Daha sonra, lipid tek tabakasının hazırlanması ve EM ızgaralarında streptavidin kristallerinin büyümesi için talimatlar açıklanmaktadır. Ek olarak, negatif leke EM ve kriyo-EM deneylerinde streptavidin afinite ızgaralarının kullanımı için talimatlar verilmiştir. Son olarak, kriyo-EM verileri elde edildikten sonra streptavidin sinyalinin mikrograflardan çıkarılması için prosedürler sağlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

Streptavidin afinite ızgaraları, numune denatürasyonu ve hava-su arayüzü nedeniyle meydana gelebilecek tercihli yönelimler dahil olmak üzere, yaygın olarak karşılaşılan birçok kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) numune hazırlama zorluğunun üstesinden gelmek için stratejiler sağlar. Bununla birlikte, Streptavidin afinite ızgaraları şu anda birkaç kriyo-EM laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır, çünkü ticari olarak mevcut değildirler ve dikkatli bir üretim süreci gerektirirler. İki boyutlu streptavidin kristalleri, doğrudan standart delikli karbon kriyo-EM ızgaralarına uygulanan biyotinillenmiş bir lipid tek tabakası üzerinde büyütülür. Streptavidin ve biyotin arasındaki yüksek afiniteli etkileşim, kriyo-EM numune hazırlama sırasında hava-su arayüzünden korunan biyotinillenmiş numunelerin daha sonra bağlanmasına izin verir. Ek olarak, bu ızgaralar, sınırlı miktarlarda bulunan numuneleri konsantre etmek ve ilgilenilen protein komplekslerini doğrudan ızgaralar üzerinde saflaştırmak için bir strateji sağlar. Burada, kriyo-EM ve negatif leke deneylerinde kullanılmak üzere streptavidin afinite ızgaralarının sağlam üretimi için adım adım, optimize edilmiş bir protokol sağlanmıştır. Ek olarak, streptavidin afinite ızgaralarının kullanımını daha büyük kriyo-EM topluluğu için daha erişilebilir hale getirmek için yaygın olarak karşılaşılan zorluklar için bir sorun giderme kılavuzu dahil edilmiştir.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

Yazar Spotlight: Streptavidin-Biotin Yaklaşımı ile Cryo-EM Numune Hazırlamanın Geliştirilmesi

Kriyo-Elektron Mikroskobu Numune Hazırlama için Streptavidin-Afinite Izgarası İmalatı

There have been many recent technological advances in cryo-EM, including advancements in the microscope hardware itself that improve the overall quality of the images, and also developments in software that are used to process the cryo-EM images that can start to deal with the large amounts of heterogeneity present in many of the samples. The sample preparation remains one of the largest bottlenecks in cryo-EM. The sample quantity may be limiting and proteins tend to absorb to the hydrophobic air-water interface during vitrification.This can lead to sample denaturation, the breaking apart of larger protein complexes and preferred particle orientations that are present in the cryo-EM images. These grids take advantage of the high-affinity interaction between streptavidin and biotin to tether biotinylated samples and protect them from the hydrophobic air-water interface. We can work with very low sample amounts, and random biotin elation of samples offers a strategy to overcome preferential orientation issues that may be observed when using other support layers.

Adım 3.21'deki karbon buharlaşmasından sonra (genellikle bir hafta sonra), streptavidin afinite ızgaraları, adım 4 ve 5'te açıklanan prosedürleri izleyerek kriyo-EM veya negatif leke numunesi hazırlama için kullanılabilir. Streptavidin afinite ızgaraları ile donmuş biyotinillenmiş bir numunenin 1.05 şpiksel boyutuna sahip 81.000X büyütmede bir titan Krios üzerinde bir K3 dedektörü kullanılarak yakalanan temsili bir mikrograf Şekil 4A'da gösterilmektedir. Başarılı kafes oluşumu, görüntünün arka planında görünen sürekli ızgara deseni ile gözlemlenir. Bu, Şekil 4A'da (sağda) gösterilen hızlı Fourier dönüşümünde (FFT) görünen kırınım modeli ile daha kolay gözlemlenebilir. Veri toplandıktan sonra, bu protokolün 6. adımında özetlenen prosedürü izleyerek, streptavidin kafesi tarafından görüntüye katkıda bulunan sinyal, sonraki veri işleme adımları için kullanılabilecek çıkarılmış bir mikrograf (Şekil 4B) üretmek için hesaplamalı olarak maskelenebilir. Şekil 4B'deki (sağda) FFT, Şekil 4A'da (sağda) gözlemlenen kırınım modelinin orijinal görüntüden başarıyla kaldırıldığını göstermektedir.
Şekil 4C , streptavidin afinite ızgaralarına bağlı ve uranil format kullanılarak negatif olarak boyanmış biyotinillenmiş bir numunenin 1.6 şpiksel boyutuna sahip 49.000x büyütmede bir Tecnai 12 mikroskobunda alınan örnek bir mikrografı göstermektedir. Izgaralar, bu protokolün 4. adımında belirtilen prosedür izlenerek hazırlandı ve daha kalın bir leke filmi bırakıldı.
Streptavidin ızgara üretim prosedürü başarısız olduğunda, tartışma bölümünde ve Tablo 1'de daha ayrıntılı olarak açıklanan birkaç yaygın gözlem vardır . Şekil 5 bu gözlemlerin birkaç örneğini göstermektedir. Şekil 5A , altı aydan daha eski bir partiden kullanılan negatif lekeli bir streptavidin afinite ızgarasının bir mikrografını göstermektedir. Tek tabaka, kuantifon ızgaraların karbon folyosundaki deliklerden hareketlenmiştir ve ızgaradaki deliklere benzer boyutlarda gözlenir. Şekil 5B , numune hazırlama prosedürleri sırasında kolayca bozulan yüksek mozaikliğe sahip streptavidin kristallerinin bir örneğini göstermektedir. Şekil 5C , adım 3.21'deki karbon buharlaşmasının çok ince olduğu veya ihmal edildiği bir streptavidin afinite ızgarasından temsili bir mikrografı göstermektedir. Streptavidin kafesi, kriyo-EM numune hazırlama işlemi sırasında parçalanmıştır. Şekil 5D , muhtemelen adım 3.13 sırasında yetersiz yıkama veya ızgaranın altın tarafının 3.13-3.20 adımlarında ıslanması nedeniyle lipid veziküllerinden kontaminasyona sahip negatif lekeli bir streptavidin afinite ızgarasını göstermektedir. Bu yaygın sorunların üstesinden gelmeye yönelik stratejiler için lütfen tartışma bölümüne ve Tablo 1'e bakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Şekil 1: Streptavidin afinite ızgarası üretim prosedürünün şeması. (A) Streptavidin afinite ızgarası üretim prosedürünün genel bakış zaman çizelgesi. Tüm prosedür, karbonun yeterince yaşlanmasına izin vermek için iki karbon buharlaştırma adımı ve her birinden bir hafta sonra iki hafta boyunca tamamlanabilir. (B) Altın külçeler ve delikli karbon filmli standart kriyo-EM ızgarası, ilk buharlaştırılmış karbon tabakası, lipid tek tabakası, 2D-streptavidin kristali ve arka taraf buharlaştırılmış karbon destek tabakası dahil olmak üzere, imalat sürecinin tamamlanmasından sonra ızgarayı oluşturan katmanları gösteren bir streptavidin afinite ızgarasının ızgara karesi görünümünde yakınlaştırılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Şekil 2: Lipid tek tabakası ve streptavidin kristalizasyonu (A) Lipid tek tabakasını oluştururken sabit yüzey basıncı oluşturan hint yağı için bir sınır oluşturmak için talk pudrası kullanan küçük Petri kabı içinde lipid tek tabakasının nasıl başarılı bir şekilde oluşturulacağını gösteren resimler. (B) Streptavidin kristallerinin kriyo-EM ızgaralarında nasıl büyütüleceğini gösteren resimler. İlk olarak, ızgaraların karbon tarafı lipit tek tabakasına dokundurulur ve ardından kristalizasyon tamponunda art arda üç yıkama yapılır. Streptavidin eklenir ve ızgaralar 2 saat boyunca bir nem odasında inkübe edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Şekil 3: Mikrograflardan streptavidin kafes çıkarma işlemini gerçekleştirmek için process_subtraction.cfg dosyası için örnek parametreler (adım 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Şekil 4: Başarılı streptavidin afinite ızgarası üretiminin temsili sonuçları. (A) Ev yapımı streptavidin afinite ızgaraları ile hazırlanan biyotinillenmiş protein / nükleozom komplekslerinin Cryo-EM mikrografı. FFT sağda gösterilmiştir ve streptavidin kristal kırınım modelini gösterir. (B) Panel A'dakiyle aynı mikrograf, orijinal görüntüden 2D streptavidin kristalinden gelen sinyali çıkarmak için kafes çıkarma prosedürünü takiben gösterilir. (C) Streptavidin afinite ızgaralarına bağlı biyotinillenmiş bir numunenin negatif boyanmasından elde edilen bir mikrograf örneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Şekil 5: Başarısız streptavidin afinite ızgarası imalatının temsili sonuçları. (A) Izgaralar altı aydan eski olduğunda streptavidin tek tabakasının ızgara deliklerinden mobilizasyonunu gösteren mikrograf. (B) Hem kriyo-EM hem de negatif leke numune hazırlama prosedürleri sırasında kolayca zarar gören yüksek mozaikliğe sahip streptavidin kafeslerini gösteren mikrograf. (C) Adım 3.21'deki karbon buharlaşma tabakası çok ince olduğunda veya ihmal edildiğinde, kriyo-EM numune hazırlama sırasında streptavidin kafesinin parçalanmasını gösteren mikrograf. (D) Adım 3.13 sırasında yetersiz yıkama veya adım 3.13-3.20 sırasında ızgaranın altın tarafının ıslanması nedeniyle lipid vezikülleri ile kontamine olmuş temsili mikrograf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Başarısız streptavidin afinite ızgarası üretimi sırasında karşılaşılan yaygın olarak karşılaşılan zorlukların üstesinden gelmek için sorun giderme kılavuzu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation at JoVE.com

Kriyo-elektron mikroskobu ile zorlu makromoleküler numunelerin yapısal çalışmalarında kullanılmak üzere streptavidin afinite ızgaralarının üretilmesi için adım adım bir protokol sağlanmıştır.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Kriyo-EM'de, mikroskop donanımının kendisinde görüntülerin genel kalitesini artıran gelişmeler ve ayrıca kriyo-EM görüntülerini işlemek için kullanılan yazılımdaki gelişmeler de dahil olmak üzere, örneklerin çoğunda bulunan büyük miktarlarda heterojenlik ile başa çıkmaya başlayabilen birçok yeni teknolojik gelişme olmuştur. Numune hazırlama, cryo-EM'deki en büyük darboğazlardan biri olmaya devam ediyor. Numune miktarı sınırlayıcı olabilir ve proteinler vitrifikasyon sırasında hidrofobik hava-su arayüzüne emilme eğilimindedir.Bu, numune denatürasyonuna, daha büyük protein komplekslerinin parçalanmasına ve kriyo-EM görüntülerinde bulunan tercih edilen parçacık yönelimlerine yol açabilir. Bu ızgaralar, biyotinillenmiş numuneleri bağlamak ve onları hidrofobik hava-su arayüzünden korumak için streptavidin ve biyotin arasındaki yüksek afiniteli etkileşimden yararlanır. Çok düşük numune miktarları ile çalışabiliriz ve numunelerin rastgele biyotin elasyonu, diğer destek katmanları kullanılırken gözlemlenebilecek tercihli oryantasyon sorunlarının üstesinden gelmek için bir strateji sunar.

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.4K Görüntüleme.  University of California, Berkeley. Kriyo-EM'de, mikroskop donanımının kendisinde görüntülerin genel kalitesini artıran gelişmeler ve ayrıca kriyo-EM görüntülerini işlemek için kullanılan yazılımdaki gelişmeler de dahil olmak üzere, örneklerin çoğunda bulunan büyük miktarlarda heterojenlik ile başa çıkmaya başlayabilen birçok yeni teknolojik gelişme olmuştur. Numune hazırlama, cryo-EM'deki en büyük darboğazlardan biri olmaya devam ediyor. Numune miktarı sınırlayıcı olabilir ve proteinler ...