T.C. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences molecular biophysics training grant GM-08295 e pela National Science Foundation graduate research fellowship sob o número de bolsa DGE 2146752. R.G. e B.H. foram apoiados pela bolsa R21-GM135666 do Instituto Nacional de Saúde concedida a R.G. e B.H. Este trabalho foi parcialmente financiado através da bolsa R35-GM127018 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais concedida a E.N. E.N. é um investigador do Howard Hughes Medical Institute.

Fabricação de grades de afinidade de estreptavidina para estudos estruturais de crio-EM

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. 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R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. 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Nosso protocolo descreve como fazer e usar grades de afinidade de estreptavidina e como processar os dados contendo o sinal de difração de estreptavidina. Existem várias etapas críticas no protocolo que requerem atenção especial.
Lotes de grade malsucedidos podem ser rastreados até vários erros comuns. A fonte mais comum de erro vem do uso de reagentes desatualizados ou de baixa qualidade. É especialmente importante preparar a solução lipídica biotinilada exatamente como descrito no protocolo. Além disso, quaisquer impurezas, como resíduos de detergente no material de laboratório ou óleos naturalmente presentes na pele, podem afetar a qualidade dos cristais de estreptavidina e, portanto, a qualidade das imagens resultantes. Por conseguinte, recomenda-se a realização de três ciclos de lavagem das redes antes da primeira evaporação de carbono para remover uma possível contaminação por tensoactivos do fabricante da rede (passo 2.1). Além disso, a contaminação ou impureza do óleo de mamona tem sido observada para dificultar a formação de cristais na grade.
Fazer e pegar a monocamada lipídica é uma tarefa que deve ser praticada algumas vezes para se ter uma noção dos pequenos volumes lipídicos. Não é incomum que essa etapa falhe nas primeiras duas ou três vezes antes que uma monocamada lipídica adequada possa ser produzida, como se reflete, em última análise, na qualidade dos cristais de estreptavidina, que são vistos em grades coradas negativamente (Figura 4C).
É importante nunca deixar a parte traseira (lado ouro, lado lipídico) da grade ficar molhada durante o processo de fabricação da grade (etapas 3.12-3.20). Caso a parte traseira fique molhada, recomenda-se descartar a grade. Isso pode resultar no aparecimento de grandes vesículas lipídicas que prejudicam a qualidade da imagem (Figura 5D) (Linha 3, Tabela 1). Vesículas lipídicas também podem ser observadas devido à lavagem insuficiente após a aplicação da monocamada lipídica (passo 3.13). Três lavagens subsequentes usando tampão de cristalização são recomendadas após tocar a monocamada lipídica antes da adição de estreptavidina.
Depois que uma fina camada de carbono foi evaporada em grades embutidas em trealose, a parte traseira da grade pode ser molhada sem danificar a qualidade da rede. Por exemplo, a umectação da parte traseira é frequentemente observada quando o tampão da amostra contém quantidades mínimas de detergente. A umectação da parte traseira pela amostra pode resultar na ligação inespecífica das amostras ao filme fino de carbono na parte traseira, o que diminui a eficácia de impedir que as partículas se difundam para a interface ar-água ou o uso de ligação de afinidade para estratégias de purificação on-grid. Se possível, adicione a amostra à grelha na ausência de detergente. Detergente e outros aditivos podem ser posteriormente adicionados durante as etapas de lavagem da grade ou adicionados em uma etapa final antes da vitrificação. Esta é uma limitação ao uso de grades de afinidade estreptavidina; no entanto, se o objetivo é melhorar a orientação preferencial, o preparo da amostra com tampões, incluindo detergente, tem sido realizado com sucesso11.
Uma fonte comum de erro pode ser atribuída à idade das grades em relação a ambas as etapas de evaporação de carbono (passo 2.3 e passo 3.21). Neste protocolo, o período de espera recomendado é de 5-7 dias após a evaporação do carbono no backside antes do uso de grades de estreptavidina para crio-EM. Quando as grades são usadas muito cedo após a fabricação, a rede e a monocamada lipídica foram observadas para se mobilizar para fora dos orifícios da grade. Observação semelhante pode ser feita quando as grades são muito antigas e utilizadas após seis meses (Figura 5A) (Linha 1, Tabela 1). Nós hipotetizamos que esta observação é explicada por mudanças na hidrofobicidade do carbono que é aplicado para estabilizar a monocamada lipídica e cristais de estreptavidina. Além disso, as redes de estreptavidina podem aparecer em mosaico (Figura 5B) (Linha 3, Tabela 1) e quebradas tanto em coloração negativa quanto em crio-ME se a monocamada for aplicada a grades onde a primeira camada de evaporação de carbono (etapa 2.3) não envelheceu suficientemente.
Uma fonte comum adicional de erro pode ser atribuída à fragilidade da monocamada cristalina de estreptavidina (a monocamada lipídica é fluida e pode se expandir ou comprimir reversivelmente). A evaporação de carbono na parte traseira (etapa 3.21) fornece estabilidade crítica à rede de monocamada e estreptavidina durante o processo de adsorção, lavagem e blotting de crio-EM. Na ausência de evaporação de carbono suficiente para a parte posterior da grade, as redes de estreptavidina geralmente aparecerão fragmentadas após o blotting/congelamento (Figura 5C) (Linha 2, Tabela 1). Neste protocolo, sugerimos o uso de um congelador de imersão automatizado unilateral para blotting unilateral. Este método produz condições de blotting altamente reprodutíveis que preservam a rede de estreptavidina durante o processo de congelamento e permitem a otimização simplificada da aplicação da amostra e dos parâmetros de blotting. Alternativamente, outros equipamentos automatizados de congelamento de imersão têm sido usados em combinação com o blotting manual. Para fazer isso, a função de blotting real é desativada nas configurações do dispositivo, e a grade é manchada em vez disso, alcançando com um par de pinças segurando papel de mancha através da entrada lateral. Este método pode obter resultados de alta qualidade para laboratórios sem um dispositivo de congelamento de blotting e imersão unilateral; no entanto, a reprodutibilidade grid-to-grid é um desafio.
Embora o uso de grades de afinidade com estreptavidina tenha muitas vantagens, algumas limitações desse método precisam ser levadas em consideração. Devido à natureza do procedimento, geralmente não é possível avaliar a qualidade da rede de estreptavidina até que todo o processo tenha sido concluído. Sugere-se selecionar rapidamente a qualidade de cada lote por coloração negativa antes de congelar as amostras. Devido ao sinal contribuído pela rede estreptavidina para as imagens brutas, pode ser desafiador em alguns casos avaliar, apenas a partir das imagens, se há um número suficiente de partículas intactas e dispersas. Pela mesma razão, o processamento em tempo real de dados crio-EM durante a aquisição de dados não é possível, a menos que o procedimento de subtração do sinal de estreptavidina tenha sido incluído no pipeline de pré-processamento de dados. Como o sinal de estreptavidina é geralmente subtraído das imagens corrigidas por movimento e não dos quadros em si, o polimento bayesiano, como implementado em suítes de software populares, pode falhar ao usar os procedimentos de subtração conforme descrito. Recomenda-se, portanto, a correção do movimento em múltiplos remendos para minimizar o movimento das partículas desde o início do processamento dos dados16.
Apesar dessas limitações, as grades de afinidade com estreptavidina oferecem muitas vantagens. Duas grandes vantagens que as grades de afinidade de estreptavidina fornecem sobre as grades crio-EM de orifício aberto padrão são um meio de proteger as amostras da interface ar-água e concentrar amostras de baixa abundância (10-100 nM) na grade. Outras camadas de suporte, como o carbono e o óxido de grafeno, também podem ser usadas como estratégias para superar esses gargalos de preparação de amostras. Em um exemplo, grades de afinidade de estreptavidina foram a única solução para obter uma reconstrução intacta de uma interação proteína-ácido nucleico que era incompatível com abordagens de reticulação. 12º
Outra grande vantagem que as grades de afinidade com estreptavidina proporcionam é uma solução para amostras que adsorvem a outras camadas de suporte, como óxido de carbono ou grafeno, com orientações preferenciais que dificultam a capacidade de obter uma reconstrução 3D da amostra de interesse. A biotinilação aleatória de amostras usando kits comercialmente disponíveis permite a fixação aleatória da amostra de interesse à monocamada de estreptavidina, a fim de obter mais visualizações potenciais para superar este desafio.
Além disso, as grades de afinidade estreptavidina, oferecem vantagens exclusivas das grades baseadas em afinidade. A alta afinidade e especificidade da interação estreptavidina-biotina permitem o acoplamento de grades de afinidade de estreptavidina com outros fluxos de trabalho que envolvem biotina para purificar complexos de interesse. Em um exemplo publicado, os autores imobilizaram um complexo em grades de afinidade de estreptavidina, e incubaram um parceiro de ligação de estequiometria desconhecida em grande excesso. Após a lavagem de qualquer proteína não ligada, o supercomplexo corretamente montado foi obtido e imediatamente analisado com crio-EM11. Uma possível aplicação futura pode ser combinar etiquetas proteicas ligadoras de estreptavidina, o sistema Avi-tag ou abordagens de marcação por proximidade com grades de afinidade por estreptavidina, para extrair proteínas individuais e/ou complexos proteicos diretamente de fontes recombinantes ou endógenas sem esquemas de purificação elaborados padrão.
Ao fornecer este protocolo, os laboratórios devem ser capazes de reproduzir facilmente a fabricação de grades de afinidade por estreptavidina, estabelecendo-as como uma ferramenta mais comumente usada para análise estrutural de complexos proteicos por crio-EM.

A criomicroscopia eletrônica (crio-EM) revolucionou o campo da biologia estrutural ao permitir a determinação da estrutura macromolecular de amostras grandes, flexíveis e heterogêneas que antes eram inacessíveis por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear1. Este método funciona congelando macromoléculas em solução para criar uma fina camada de gelo vítreo que pode ser posteriormente fotografada usando um microscópio eletrônico. Nos últimos anos, avanços significativos tanto no hardware do microscópio quanto no software de processamento de imagens expandiram ainda mais os tipos de amostras adequadas para a determinação de estruturas de alta resolução por crio-EM.
No entanto, a preparação de amostras finas e vitrificadas continua sendo uma das etapas mais críticas na determinação da estrutura macromolecular por crio-EM. As amostras biológicas são frequentemente dinâmicas, frágeis, propensas à desnaturação e, às vezes, só estão disponíveis em pequenas quantidades para estudos de crio-EM. Durante o processo de blotting, essas partículas interagem com a interface hidrofóbica ar-água, o que pode resultar em orientações preferenciais de partículas, desmontagem de complexos frágeis, desnaturação parcial ou completa da amostra e agregação 2,3,4. O uso de detergentes ou outros surfactantes, a reticulação química e a adsorção de amostras para camadas de suporte são estratégias comuns para preservar amostras biológicas durante o processo de congelamento. Camadas de suporte como óxido de grafeno 5,6,7 ou carbonoamorfo 8 também funcionam para concentrar partículas na grade por adsorção quando a amostra está disponível em quantidades limitadas. No entanto, esses métodos não são gerais ou confiáveis, e a otimização da preparação da grade pode ser extremamente demorada ou falhar completamente.
Gradesde afinidade com estreptavidina9,10 foram desenvolvidas para superar essas deficiências e fornecer um método suave e geralmente aplicável para sequestrar o complexo de interesse e protegê-lo da interface ar-água. Essas grades utilizam uma rede cristalina de estreptavidina bidimensional (2D) cultivada sobre uma monocamada de lipídios biotinilados na grade. Depois que as amostras são biotiniladas (muitas vezes de forma esparsa e aleatória, o que significa uma biotina por complexo em média), elas podem ser aplicadas à grade revestida com estreptavidina. Como a adsorção da amostra depende da afinidade extremamente alta entre estreptavidina e biotina, concentrações de amostra tão baixas quanto 10 nM podem ser usadas com essas grades. Kits de biotinilação comercialmente disponíveis para proteínas e primers biotinilados para complexos contendo DNA tornam relativamente fácil anexar as metades de biotina necessárias à maioria das amostras de interesse. Além de concentrar a amostra e mantê-la longe da interface ar-água prejudicial durante o blotting, a biotinilação aleatória de um ou apenas alguns resíduos de lisina pode melhorar significativamente a gama de orientações da molécula de interesse na grade crio-EM, como demonstrado em vários estudos11. Enquanto o sinal do cristal de estreptavidina subjacente está presente nas imagens brutas, esquemas de processamento de dados envolvendo a filtração de Fourier das reflexões nítidas de Bragg do cristal podem ser facilmente removidos durante o processamento inicial dos dados, permitindo, em última análise, reconstruções de alta resolução da amostra de interesse 11,12,13. Aqui, um protocolo passo a passo otimizado é fornecido para a produção robusta de grades de afinidade de estreptavidina e uso subsequente em experimentos de crio-EM. Espera-se que o protocolo fornecido seja concluído em um período de 2 semanas (Figura 1A). As primeiras partes do protocolo descrevem a preparação de reagentes, o pré-tratamento de grades e as primeiras etapas de evaporação de carbono. A seguir, são descritas instruções para a preparação da monocamada lipídica e o crescimento de cristais de estreptavidina em grades de EM. Além disso, são fornecidas instruções para o uso de grades de afinidade com estreptavidina em experimentos de coloração negativa EM e crio-EM. Finalmente, são fornecidos procedimentos para remover o sinal de estreptavidina das micrografias uma vez que os dados de crio-EM tenham sido adquiridos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

As grades de afinidade por estreptavidina fornecem estratégias para superar muitos desafios comumente encontrados de preparação de amostras por crio-microscopia eletrônica (crio-EM), incluindo desnaturação da amostra e orientações preferenciais que podem ocorrer devido à interface ar-água. Grades de afinidade com estreptavidina, no entanto, são atualmente utilizadas por poucos laboratórios de crio-EM porque não estão disponíveis comercialmente e requerem um processo de fabricação cuidadoso. Cristais bidimensionais de estreptavidina são cultivados em uma monocamada lipídica biotinilada que é aplicada diretamente às grades padrão de crio-EM holey-carbono. A interação de alta afinidade entre estreptavidina e biotina permite a ligação subsequente de amostras biotiniladas que são protegidas da interface ar-água durante a preparação de amostras crio-EM. Além disso, essas grades fornecem uma estratégia para concentrar amostras disponíveis em quantidades limitadas e purificar complexos proteicos de interesse diretamente nas grades. Aqui, um protocolo passo a passo otimizado é fornecido para a fabricação robusta de grades de afinidade de estreptavidina para uso em experimentos de crio-EM e coloração negativa. Além disso, um guia de solução de problemas está incluído para desafios comumente experimentados para tornar o uso de grades de afinidade de estreptavidina mais acessível para a comunidade crio-EM maior.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

Autor em destaque: Aprimorando a preparação de amostras de crio-EM com a abordagem estreptavidina-biotina

Fabricação de grade de afinidade por estreptavidina para preparação de amostras de microscopia crio-eletrônica

Após a evaporação do carbono na etapa 3.21 (geralmente após uma semana), grades de afinidade por estreptavidina podem ser usadas para a preparação de amostras de crio-EM ou de coloração negativa seguindo os procedimentos descritos nas etapas 4 e 5. Uma micrografia representativa capturada usando um detector K3 em um titã Krios em aumento de 81.000X com um tamanho de pixel de 1,05 Å de uma amostra biotinilada congelada com grades de afinidade de estreptavidina é mostrada na Figura 4A. A formação bem-sucedida da rede é observada pelo padrão de grade contínua que aparece no fundo da imagem. Isso pode ser mais facilmente observado pelo padrão de difração que aparece na transformada rápida de Fourier (FFT) mostrada na Figura 4A (à direita). Após a coleta de dados, seguindo o procedimento descrito na etapa 6 deste protocolo, o sinal que é contribuído para a imagem pela rede de estreptavidina, pode ser mascarado computacionalmente para produzir uma micrografia subtraída (Figura 4B) que pode ser usada para as etapas subsequentes do processamento de dados. O FFT da Figura 4B (direita) mostra que o padrão de difração observado na Figura 4A (direita) foi removido com sucesso da imagem original.
A Figura 4C mostra um exemplo de micrografia obtida em um microscópio Tecnai 12 com um aumento de 49.000x com um tamanho de pixel de 1,6 Å de uma amostra biotinilada ligada a grades de afinidade de estreptavidina e corada negativamente usando formato de uranila. As grades foram preparadas seguindo o procedimento descrito na etapa 4 deste protocolo, deixando-se uma película de coloração mais espessa.
Há várias observações comuns quando o procedimento de fabricação da grade de estreptavidina não é bem-sucedido, que são descritas mais adiante na seção de discussão e na Tabela 1. Figura 5 mostra vários exemplos dessas observações. A Figura 5A mostra uma micrografia de uma grade de afinidade por estreptavidina, corada negativamente, usada a partir de um lote feito com mais de seis meses de idade. A monocamada foi mobilizada a partir dos furos na folha de carbono das grades quantitativas e é observada com dimensões semelhantes aos furos na grade. A Figura 5B mostra um exemplo de cristais de estreptavidina que apresentam alta mosaicidade e que se tornam facilmente perturbáveis durante os procedimentos de preparo da amostra. A Figura 5C mostra uma micrografia representativa de uma grade de afinidade por estreptavidina, na qual a evaporação do carbono na etapa 3.21 é muito fina ou omitida. A rede de estreptavidina, tornou-se fragmentada durante o processo de preparação da amostra de crio-EM. A Figura 5D mostra uma grade de afinidade por estreptavidina corada negativamente que tem contaminação por vesículas lipídicas, provavelmente devido a lavagens insuficientes durante a etapa 3.13 ou o lado dourado da grade ficando úmido durante as etapas 3.13-3.20. Consulte a seção de discussão e a Tabela 1 para obter estratégias para superar esses problemas comuns.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do procedimento de fabricação da grade de afinidade com estreptavidina. (A) Cronograma geral do procedimento de fabricação da grade de afinidade com estreptavidina. Todo o procedimento pode ser concluído ao longo de duas semanas, exigindo duas etapas de evaporação de carbono e uma semana após cada uma para permitir que o carbono envelheça suficientemente. (B) Ampliado em vista de um quadrado de grade de uma grade de afinidade de estreptavidina, mostrando as camadas que compõem a grade após a conclusão do processo de fabricação, incluindo a grade crio-EM padrão com barras de ouro e filme holey-carbono, a primeira camada de carbono evaporado, monocamada lipídica, cristal de estreptavidina 2D e a camada de suporte de carbono evaporado na parte traseira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Figura 2: Cristalização da monocamada lipídica e estreptavidina (A) Imagens demonstrando como formar com sucesso a monocamada lipídica dentro da pequena placa de Petri utilizando pó de talco para criar um limite para o óleo de mamona que cria pressão superficial constante enquanto forma a monocamada lipídica. (B) Imagens demonstrando como cultivar cristais de estreptavidina em grades crio-EM. Primeiro, o lado carbono das grades é tocado na monocamada lipídica e seguido por três lavagens consecutivas no tampão de cristalização. Streptavidin é adicionado, e grades são incubadas em uma câmara de umidade por 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Figura 3: Parâmetros de exemplo para o arquivo process_subtraction.cfg para executar a subtração da rede estreptavidina a partir de micrografias (etapa 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos da fabricação bem-sucedida da grade de afinidade por estreptavidina. (A) Micrografia crio-EM de complexos proteína/nucleossomo biotinilados preparados com grades de afinidade caseiras de estreptavidina. A FFT é mostrada à direita e mostra o padrão de difração de cristais de estreptavidina. (B) A mesma micrografia do painel A é mostrada seguindo o procedimento de subtração em rede para remover o sinal do cristal de estreptavidina 2D da imagem original. (C) Um exemplo de micrografia obtida a partir de coloração negativa de uma amostra biotinilada ligada a grades de afinidade por estreptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos da fabricação malsucedida da grade de afinidade com estreptavidina. (A) Micrografia mostrando a mobilização da monocamada de estreptavidina dos orifícios da grade quando as grades têm mais de seis meses. (B) Micrografia mostrando reticulados de estreptavidina, com alta mosaicidade, que são facilmente danificados durante os procedimentos de preparação de amostras crio-EM e de coloração negativa. (C) Micrografia mostrando fragmentação da rede de estreptavidina, durante a preparação da amostra de crio-EM, quando a camada de evaporação de carbono na etapa 3.21 é muito fina ou omitida. (D) Micrografia representativa que está contaminada com vesículas lipídicas provavelmente devido à lavagem insuficiente durante a etapa 3.13 ou ao lado dourado da grade que fica molhado durante as etapas 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Guia de solução de problemas para superar os desafios comumente experimentados que são encontrados durante a fabricação malsucedida da grade de afinidade de estreptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Supplemental Coding File 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Supplemental Coding File 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation at JoVE.com

Um protocolo passo-a-passo para a fabricação de grades de afinidade à estreptavidina é fornecido para uso em estudos estruturais de amostras macromoleculares desafiadoras por microscopia crio-eletrônica.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Houve muitos avanços tecnológicos recentes em crio-EM, incluindo avanços no próprio hardware do microscópio que melhoram a qualidade geral das imagens, e também desenvolvimentos em softwares que são usados para processar as imagens crio-EM que podem começar a lidar com as grandes quantidades de heterogeneidade presentes em muitas das amostras. A preparação da amostra continua sendo um dos maiores gargalos na crio-EM. A quantidade de amostra pode ser limitante e as proteínas tendem a absorver a interface hidrofóbica ar-água durante a vitrificação.Isso pode levar à desnaturação da amostra, à quebra de complexos proteicos maiores e às orientações de partículas preferidas que estão presentes nas imagens crio-EM. Essas grades aproveitam a interação de alta afinidade entre estreptavidina e biotina para amarrar amostras biotiniladas e protegê-las da interface hidrofóbica ar-água. Podemos trabalhar com quantidades de amostras muito baixas, e a elinação aleatória de biotina das amostras oferece uma estratégia para superar problemas de orientação preferencial que podem ser observados ao usar outras camadas de suporte.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.6K visualizações.  University of California, Berkeley. Houve muitos avanços tecnológicos recentes em crio-EM, incluindo avanços no próprio hardware do microscópio que melhoram a qualidade geral das imagens, e também desenvolvimentos em softwares que são usados para processar as imagens crio-EM que podem começar a lidar com as grandes quantidades de heterogeneidade presentes em muitas das amostras. A preparação da amostra continua sendo um dos maiores gargalos na crio-EM. A quantidade de amostra pode ser limitante e as proteínas tendem ...

Vídeo: Autor em destaque: Aprimorando a preparação de amostras de crio-EM com a abordagem estreptavidina-biotina

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.