多鼠脑的同时 Cryosectioning

这种节省时间的方法减少了神经科学研究中免疫组织化学程序几轮之间的变异性，以优化解剖学和局部蛋白质和组织之间的可视化。这项技术的主要优点是，通过将多个大脑组合成一个冷冻块，减少了冷冻和安装脑组织的时间。虽然这项技术针对啮齿动物大脑的冠状部分进行了优化，但它可以适应下垂或横向部分或不同类型的组织，如肌肉或肝脏。

在成功的转心输注后，在PBS中25毫升小瓶中修复动物的大脑，24小时使用4%的甲状甲醛。在此之后，使用钝倾斜钳将大脑从半甲醛中去除。将大脑转移到一个小瓶中，在TBS中用大约20毫升的30%蔗糖溶液。

保持大脑和溶液，直到他们沉入小瓶的底部。接下来，将一个500毫升的玻璃烧杯放在冰桶的干冰床上。然后将300至400毫升异丙烷倒入烧杯中。

保持负45和负50摄氏度之间的异丙烷。在台面上，用最佳切割温度或 OCT 化合物填充一次性嵌入模具，大约一半满。使用针头清除模具上的任何气泡。

使用钝尖钳将第一个大脑从蔗糖溶液中去除。然后使用新的剃须刀刀片去除小脑和嗅觉灯泡，然后再分离半球。接下来，给大脑一个数字命名系统。

使用钝钳，拿起大脑被放置在第二位，并定向与侧被削减第一面朝上。将大脑放入 OCT 中，并使用钳子调整其位置，直到它独立站立。此技术的一个关键修改是位置 1 中的空白。

此空间被指定，以便于识别巨脑方向，从而识别与每个大脑相关的动物。所有大脑都位于模具中后，添加足够的 OCT 来覆盖大脑顶部，然后用针头去除任何气泡。用钳子握住模具的一角，确保钳子不会部分淹没在 OCT 中。

然后，将模具降低为异丙烷，使模具的底部三分之一被淹没。30 秒后，将整个模具降低至异丙烷中，然后从钳子中释放。三分钟后，使用钳子从异丙烷上去除模具。

立即将模具及其内装物包裹在铝箔中，并适当地贴上标签。将巨型脑转移到负 20 摄氏度的冰柜中至少 24 小时。首先，将低温柜的温度设置为负 19 摄氏度。

从冰柜中取出巨型脑，放在低温箱中。然后在低温恒温器中放置一个夹头和两个薄尖的画笔。在此之后，使用巨型脑标识号和幻灯片编号标记幻灯片，然后将幻灯片放在幻灯片加热器上。

接下来，解开巨型脑，用剃刀刀片切割模具的角落。将一层薄薄的 OCT 分配到夹头上。然后迅速将巨型脑放在夹头上。

OCT 完全冻结后，在巨型脑的两侧周围涂抹两毫米的 OCT 层，并允许其沿着夹头的两侧运行。使用剃须刀刀片从夹头的侧面和底部清除多余的 OCT。首先，将装有巨型脑的夹头放在低温恒温器的夹头上。

然后将低温恒温器设置为所需的厚度。根据需要修剪 OCT 和组织，以达到所需的大脑区域进行组织采集。然后降低防卷板，直到它放在舞台上，转动低温手柄，采取一个单一的部分。

慢慢提起防卷板，小心组织部分不接触。轻轻地使用画笔展开组织部分，直到它平躺。如果需要，使用画笔握住 OCT 平，以防止滚动。

然后从幻灯片加热器上取下幻灯片，将幻灯片标签侧悬停在巨型脑部分上方，并允许其粘到幻灯片上。快速将 PBS 滴到组织部分。使用浸在 PBS 中的细尖画笔，刷掉组织部分的任何气泡并展开组织，以便它平躺在幻灯片上。

最后，将幻灯片放在幻灯片加热器上干燥 45 分钟，并在负 80 摄氏度处存储幻灯片。在这个协议中，来自九种动物的脑组织同时被准备和冷冻。冷冻后，可以进行H&E染色，以评估低温保护质量。

电离钙结合适配器分子一或 Iba1 微胶质染色的代表性结果表明，每个研究大脑在单个巨型脑上一致染色。在尝试此程序时，重要的是要记住在冻结巨脑时持续监测温度，以防止开裂或解冻，然后重新冻结导致组织完整性异常的组织。不建议将不同的治疗组隔离在单独的巨脑中，因为这可能在染色过程中产生组之间的差异，并减少成像和分析期间的偏置和主观性。

不要忘记，使用甲状甲醛可能非常危险，在执行此过程时，应始终采取预防措施，例如佩戴 PBE 和在发动机罩中工作。