生物分子相互作用（包括蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 相互作用）在生物化学研究中至关重要。在这项研究中，我们使用生物膜干涉测量法 （BLI），这是一种分析这些相互作用的有效技术。我们专注于复制蛋白 A 及其对单链 DNA 的结合亲和力，以展示 BLI 的原理和能力。
生物膜干涉测量法是研究蛋白质动力学的一种简单且经济高效的方法。它允许快速实时监测蛋白质相互作用，并提供简单的工作流程，比其他技术更简单。在我们的实验室中，我们研究了翻译后修饰对维持基因组稳定性至关重要的蛋白质结构和功能的影响。
这些修饰可以启动跨复制和修复途径的级联效应。通过研究蛋白质相互作用，我们旨在揭示保护基因组完整性的潜在机制。首先，使用 BLI 缓冲液准备 12.5 纳摩尔的三种主要生物单链聚 dT 32 诱饵底物和四种浓度的 RPA。
使用移液器，在两个 0.5 ml 微量离心管中加入 250 μL BLI 缓冲液，并将它们标记为 AND。在单独的 96 孔板中，在一个孔中吸取 200 μL BLI 缓冲液。将生物传感器托盘放在 96 孔板上，使一个生物传感器浸入 BLI 缓冲液中。
在软件上，单击水合物选项并将计时器设置为 10 分钟。调整每个步骤、基线、关联和分离的运行设置。点击软件上的运行，然后按照提示消息中的说明进行作。
将两个托架放入试管架中，并将水合的生物传感器连接到 BLI 系统。将试管架滑到生物传感器下方的位置 A 并监测生物传感器的基线。完成初始基线后，打开盖子，向液滴架中加入 4 μL BLI 缓冲液。
将液滴架向右滑动到同一生物传感器下方的位置 B.合上盖子后，在软件上监测 BLI 曲线。然后打开盖子，用管 D 替换管 A，在关闭盖子之前，将新管滑到生物传感器下方的位置 A 并分析界面中的解离步骤。将试管 A 放入试管架中。
将水合的生物传感器连接到 BLI 系统，并将试管架滑到生物传感器下方，如前所述。然后单击软件界面上的运行以进行基线设置。将 4 微升 12.5 纳摩尔单链 DNA 诱饵添加到液滴架中并将其滑到生物传感器下方进行关联步骤后，在软件上监测 BLI 曲线。
然后打开盖子，用 D 替换管 A，将其滑到生物传感器下方并继续进行解离步骤。解离步骤完成后，打开盖子并拆下生物传感器。然后将生物传感器放入装有 BLI 缓冲液的托盘中。
使用移液管，将 250 微升 BLI 缓冲液添加到 10 个 0.5 毫升黑色微量离心管中。将试管标记为 A1 至 A5 和 D1 至 D5。在软件界面填写实验详情，按下计算按钮对信息进行处理。在单独的 96 孔板中，将 200 微升剥离缓冲液移液到与水合生物传感器位置相对应的孔中。
将试管 A1 放入试管架中，将诱饵涂层生物传感器连接到 BLI 系统并将试管滑到生物传感器下方后，按软件上的运行。初始基线步骤完成后，打开盖子，向液滴架中加入 4 μL BLI 缓冲液。将液滴架滑到生物传感器下方并监控 BLI 接口上的关联步骤。
用 D1 替换管 A1。将其滑到生物传感器下方并合上盖子。然后监视 BLI 接口上的分离步骤。解离步骤完成后，打开盖子，取出生物传感器并将其放回含有 BLI 缓冲液的托盘中。
然后连接诱饵涂层的生物传感器，并将试管 A2 放入试管架中。将管子滑到生物传感器下方，然后单击软件上的运行。在基线步骤之后，将 4 微升 5 纳摩尔 RPA 添加到液滴架上。
将液滴架滑到生物传感器下方并合上盖子。监控软件界面上的关联曲线。取下生物传感器并将其浸入剥离缓冲液中 30 秒。
然后将生物传感器浸入 BLI 缓冲液中 3 分钟。在标有“运行列表”的表中，选中零纳摩尔分析物浓度的参考框以用作参考曲线，选中所有浓度分析物的“分析”框。选择缔合起点和解离起点进行步骤校正，为检测选择全局拟合。
接下来，单击 analyze 以处理数据。要导出拟合数据，请右键单击从 analyze 数据生成的图形。选择 export data（导出数据），然后选择文本或数据，单击 file（文件），然后浏览以 DAT 格式保存数据。
打开软件并从左侧面板中选择 Advanced kinetics。将 96 孔板放入生物传感器托盘中并向 5 个孔中加入 200 微升 BLI 缓冲液后，将生物传感器托盘插入板中以水合传感器。当生物传感器水合时，将 250 微升 BLI 缓冲液移液到 10 个 0.5 毫升黑色离心管中。
在软件界面填写实验详情，按下计算按钮对信息进行处理。将带有管 A1 的管架滑到生物传感器下方后，单击运行以获取初始基线。向液滴架中加入 4 微升 BLI 缓冲液。
将液滴架滑到生物传感器下方，盖上盖子并监测软件中加载的曲线。使用基本动力学的 RPA 结合过程中的光谱偏移表明，在 40 纳摩尔时达到饱和，结合强度呈剂量依赖性增加。使用高级动力学的 RPA 结合过程中的光谱偏移同样显示出剂量依赖性结合，但每个浓度使用单独的生物传感器以提高准确性。
